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질문 96well에서 PBS washing 후 cell이 떨어지는 것 같습니다
알진저브래드트윅스(대학원생)  |  05.20 10:04

안녕하세요 DCFH-DA이용해 ROS assay를 진행중인 대학원생입니다.

 

벌써 3-4번정도 진행한 것 같은데 진행할 때마다 결과가 나오지 않아 스트레스 받고있는 중입니다 ㅠㅠ

 

간단히 설명드리자면 seeding->DCFH-DA treat(30min)->1X PBS washing -> 물질 Treat -> 형광도측정 이고, phenol free 배지 사용합니다.

 

고민은 다름이 아니라 결과가 나오지 않는 이유 중 하나가 제 생각에는 pbs washing시에 cell이 떨어져 나가는 것 같습니다.

 

black well로 진행을 하는데, 보통 배지 suction을 하고 나면 형광등에 비치는 well 바닥이 cell 때문에 좀 까끌한 느낌? 뭔가 붙어있는 느낌인데, pbs washing을 해주고 나면 well이 눈에 띄게 매끄러워지는 느낌입니다 ㅠㅠㅠ

 

washing은 multi pipette 이용해pbs를 100ul씩 well에 넣고 최대한 빠르게 suction해주는 방식입니다.

 

혹시 PBS 너무 오래 둬서 그런 걸까요? ㅠ

#ROS
 
#PBS washing
 
#DCFH-DA
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.

해당 셀이 뭔지 잘 모르는 관계로 정확한 답변일 수는 없으나 cell이 정상적으로 붙어 있고 접착력이 약한 셀이라는 가정 하에 답변해 볼게요. (애시당초 붙지 안는 cell을 사용하셨다면 안됩니다... 붙지 않는 셀은 튜브에서 해야해요.)

 

1. 플레이트 바닥에 충분히 붙을 시간을 주지 않은 경우.

접착셀의 경우 플레이트 바닥에 붇기 위해서는 셀에 따라 다르지만 기본적으로 하루는 필요합니다. 하지만 오버나잇으로는 애매하게 붙는 경우가 있을 수 있습니다. 이 때에는 작은 파이페팅으로도 떨어질 수 있습니다.

2. 파이페팅의 미숙.

와싱단계가 필요하고, 그 단계에서 셀이 떨어져 나간다는 것을 알았다면 버퍼를 쏘는 각도와 힘을 조절할 필요가 있습니다. 기본적으로 약한셀을 떨어뜨리지 않기 위해서는 썩션시 약한 힘으로 플레이트를 기울여서 셀이랑 최대한 떨어진 곳에서 해야 합니다. 가능하면 자연적으로 흘려서 버리는 등이요. (그냥 천천히 (완전히는 아니고) 뒤집는 방법도 있음.) 버퍼를 넣을 때에는 팁이 최대한 기울여져서 벽에 버퍼를 질질 흐를 정도로 천천히 넣어주는 것이 필요함. 단, 너무 늦으면 다른 웰에 있는 셀이 말라버리거나 실험에 영향을 줄 수 있으니 조심.

개구리절대교주  |  05.20 15:08  

절대교주님/ 답변 감사합니다! cell은 HepG2 cell이고, seeding 24시간 후에 treat 합니다! 말씀대로 좀 더 멀리서 suction해봐야겠네요. 감사합니다

알진저브래드트윅스  |  05.20 18:53  

세포가 plate에 부착하는 데는 세포와 plate 바닥간의 결합과 세포간의 결합이 작용하고, 이 결합에는 Ca2+ 이온을 cofactor로 필요로 하는 부착단백질이 관여합니다.

Ca2+ 이온이 포함되어 있지 않은 PBS로 씻어 주면 배지와 세포의 부착단백질에 포함되어 있던 Ca2+ 이온을 씻어내 결합을 약화시킵니다.

Plate에서 잘 떨어지는 세포는 PBS가 아닌 37도로 데운 배지를 사용하여 씻어 주면 세포가 떨어지는 것을 최소화할 수 있습니다.

씻어 주는 방법도 한쪽 코너 모서리를 지정해 두고 부드럽고 천천히 피펫팅해야 합니다. 세포에 유속으로 인한 충격을 최소화하기 위해 배지를 제거할 때는 위쪽에서 아래쪽으로 팁끝을 이동하면서, 첨가해 줄 때는 아래쪽에서 위쪽으로 이동하면서 첨가해 주어 배지의 낙차에 의한 충격을 최소화하는 것이 필요합니다.

PBS?  |  05.20 20:39   

저도 HepG2 cell 96well seeding 후에..

24시간 지나면 serum free로 바꾸고 pbs washing 할 때 엄청 떨어지더라구요....슬픕니다...저는 starvation 때문인것같은데 어떻게 할지 막막하네요 ㅋㅋ..

 

힘내세요...ㅠㅠ

후앗  |  05.20 21:23   
serum free media로 씻어내거나, HBSS with Ca, Mg 쓰시거나.. 핸들링에 자신이 없다면 48 well이나 24 well 등등
올챙이더잘하고싶다  |  05.21 02:04  

혹시 일반 PBS쓰시면 DPBS로 바꿔보세요. 

염농도가 조금 낮은데, PBS보다 cell이 덜 떨어지긴 하더군요. 

앞다리무광  |  05.21 04:08  
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