몇가지 질문이 있습니다.
1. template DNA는 어떤걸 사용하고 사용양(ng)은 어떻게 되나요?
2. 전체 primer 길이와 target gene 서열외에 추가된 것은 몇 mer인가요?
3. 42도에서 몇초, 59도에서 몇초, 72도에서 몇분간 반응하나요?
-
레벨1
vjrmskfn
(과기인)
-
19.05.13 09:46
1. template DNA는 어떤걸 사용하고 사용양(ng)은 어떻게 되나요?
-template DNA는 plsmid vector를 이용합니다. 사용양은 12ng입니다.
2. 전체 primer 길이와 target gene 서열외에 추가된 것은 몇 mer인가요?
전체 프라이머 길이는 25bp이고 15bp가 specific하게 붙고 나머지가 10bp정도 됩니다.
3. 42도에서 몇초, 59도에서 몇초, 72도에서 몇분간 반응하나요?
42도에서 30초 59도 30초 72도에서 약 1분간 반응시키고 있습니다.
감사합니다.
target을 포함해서 아무런 band도 안나오나요?
plasmid를 대상으로 PCR하면 대부분 잘 증폭됩니다.
primer 디자인을 조금 더 길게 했으면 좋을 것 같은데 현재 primer로
실험을 한다면
1. 45도, 30sec, 5cycs / 55도, 1min, 30cycs
2. 48도, 30sec, 5cycs / 55도, 1min, 30cycs
위 조건으로 해서 안나오면 primer를 21~24mer정도로 디자인 해서
한번 해보는건 어떨까요?
그리고 혹시 PCR kit는 어떤걸 사용하나요?
템플레이트가 정제된 단일 DNA 인가요?
그렇다면 template나 primer의 시퀀스 문제 일수 있습니다. 특히 primer 시퀀스 문제일 확률이 높아 보입니다. template가 정말 내 primer와 맞는 template인지..
너무 당연한 거라도 한번 확인해 보세요
정제된 DNA라면 그냥 막해도 왠만한 조건에서는 나옵니다. 또 primer 이상도 가끔식 나오는 문제이기도 합니다.
-
레벨1
vjrmskfn
(과기인)
-
19.05.13 11:22
1. pcr kit는 enzynomics 사용합니다.
2. dna template는 vector를 trnasfomation하여 midiprep으로 뽑아서 사용한 것을 농도를 맞춰 다시 이용하였습니다.
장비에서 허락한다면 온도를 gradient를 걸어 보는법이 가장 쉬운 조건 변경일것같습니다. 현재 안나온 온도인 42 ~ 60도 사이로 단일온도로 gradient 해보세요. 그리고 사이클수도 10/35까지 올려보세요... 일단 밴드를 만드는게 일이지 이후 사이클은 줄여서 하면 됩니다.
그런데 제 사견으로는... 정제된 DNA가 PCR이 안되다면 primer나 혹시 template가 바뀐건 아닌지 하는 의심이 드네요...
뭐 kit이야... 잘 나오는 샘플 걸어보면 kit 이상인지는 쉽게 볼수 있지 않을까 합니다.