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 전체 > Molecular Biology-DNA > PCR/RT-PCR/Q-PCR
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질문 pcr annealing tem. 질문
알vjrmskfn(과기인)  |  05.12 22:11

안녕하세요 이제 실험입문한 초보자입니다.

다름이 아니라 pcr 과정중 제가 원하는 product를 얻기위해 F R 프라이머를 짰는데 annealing 온도가 42도 정도 됩니다.

그래서 42도로 맞추고 5cycle, 추가로 프라이머에 원하는 제한효소 싸이트를 생성하고 싶은게 목적이라서 전체 프라이머에 맞는 온도로 다시 맞춘 뒤 약 59도로 annealing 온도를 맞춘뒤 25cycle을 진행하였습니다.

하지만 밴드가 뜨질 않아 질문드립니다.

pcr이 잘못된건가요?? 

#pcr
 
#annealing
 
#온도
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.

몇가지 질문이 있습니다.

1. template DNA는 어떤걸 사용하고 사용양(ng)은 어떻게 되나요?

2. 전체 primer 길이와 target gene 서열외에 추가된 것은 몇 mer인가요?

3. 42도에서 몇초, 59도에서 몇초, 72도에서 몇분간 반응하나요?

대왕개구리SPEED  |  05.12 22:45  

1. template DNA는 어떤걸 사용하고 사용양(ng)은 어떻게 되나요?

-template DNA는 plsmid vector를 이용합니다. 사용양은 12ng입니다.

2. 전체 primer 길이와 target gene 서열외에 추가된 것은 몇 mer인가요?

전체 프라이머 길이는 25bp이고 15bp가 specific하게 붙고 나머지가 10bp정도 됩니다.

3. 42도에서 몇초, 59도에서 몇초, 72도에서 몇분간 반응하나요?

42도에서 30초 59도 30초 72도에서 약 1분간 반응시키고 있습니다.

감사합니다.

알vjrmskfn  |  05.13 09:46  

target을 포함해서 아무런 band도 안나오나요?

plasmid를 대상으로 PCR하면 대부분 잘 증폭됩니다.

primer 디자인을 조금 더 길게 했으면 좋을 것 같은데 현재 primer로

실험을 한다면

1. 45도, 30sec, 5cycs / 55도, 1min, 30cycs

2. 48도, 30sec, 5cycs / 55도, 1min, 30cycs

위 조건으로 해서 안나오면 primer를  21~24mer정도로 디자인 해서

한번 해보는건 어떨까요?

그리고 혹시 PCR kit는 어떤걸 사용하나요?

대왕개구리SPEED  |  05.13 10:28  

템플레이트가 정제된 단일 DNA 인가요?

그렇다면 template나 primer의 시퀀스 문제 일수 있습니다. 특히 primer 시퀀스 문제일 확률이 높아 보입니다. template가 정말 내 primer와 맞는 template인지..

너무 당연한 거라도 한번 확인해 보세요

정제된 DNA라면 그냥 막해도 왠만한 조건에서는 나옵니다. 또 primer 이상도 가끔식 나오는 문제이기도 합니다.

금개구리안재진  |  05.13 11:20  

1. pcr kit는 enzynomics 사용합니다.

2. dna template는 vector를 trnasfomation하여 midiprep으로 뽑아서 사용한 것을 농도를 맞춰 다시 이용하였습니다.

 

알vjrmskfn  |  05.13 11:22  

장비에서 허락한다면  온도를 gradient를 걸어 보는법이 가장 쉬운 조건 변경일것같습니다. 현재 안나온 온도인 42 ~ 60도 사이로 단일온도로 gradient 해보세요. 그리고 사이클수도 10/35까지 올려보세요... 일단 밴드를 만드는게 일이지 이후 사이클은 줄여서 하면 됩니다.

그런데 제 사견으로는... 정제된 DNA가 PCR이 안되다면 primer나 혹시 template가 바뀐건 아닌지 하는 의심이 드네요...

뭐 kit이야... 잘 나오는 샘플 걸어보면 kit 이상인지는 쉽게 볼수 있지 않을까 합니다.

금개구리안재진  |  05.13 15:54  
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