단백질이 나오고 있다면 유전자가 제대로 발현되고 있는 거겠죠.
그 단백질 확인을 어떻게 했는지에 따라 다른 가설을 세울 수 있을 겁니다.
antibody를 사용했다면 붙는 부위가 어딘가에 따라서 결론이 다를 겁니다. alternative isoform이나 premature stop에 의한 truncated form, 뒷쪽이 frame-shift된 chimeric, 부분적으로 결손된 형태 등 여러가지가 여전한 단백질로 나올 수 있으니까요.
제 생각엔, 간단히 3' RACE 클로닝으로 현재 발현되고 있는 유전자의 mRNA 형태를 확인하면 해결될 듯 합니다.
both allele 모두 deletion이 된것 확인하셨나요?
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지나가다
(비회원)
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19.05.07 16:03
CRISPR/Cas9으로 knockout cell line을 만드는 원리는
무작위적인 In/del로 인해 frameshift를 일으켜 truncated protein이 만들어지도록 하는데에 있습니다.
우선 제가 이상하게 느껴지는 부분은...
1. qPCR은 RNA level을 보는 실험인데 여기서는 RNA level이 감소하지 않아야 정상이라 생각합니다. DNA level에서 deletion이 있더라도 splicing에 영향을 주지 않은 이상, RNA는 4개 서열이 deletion된 채로 만들어져야 하거든요.
2. 4개의 deletion이 일어난걸 확인한 점이 조금 이상합니다. 일반적으로 CRISPR로 특정 서열을 절단 시에, 무작위적인 In/del이 일어나서 sequencing 시에 peak가 상당히 혼재된 형태로 나타나야 합니다. 질문자께서 FACS등을 이용해 single cell을 sorting하여 culture를 한 게 아니라면, 4개의 deletion이 확인이 안 될만큼 이상하게 peak가 뜨는 게 정상입니다.
3. gRNA를 굳이 exon-intron boundary 부분에 짤 필요가 전혀 없습니다. 차라리 exon에만 (그것도 N-terminal 쪽에 가까울 수록 깨끗하게 knockout되는 것을 확인할 수 있겠죠.) 포함되도록 design 하시는 게 낫습니다. exon-intron boundary (+- 1,2 nucleotides) 부분은 splicing에 크게 기여를 하지만 사실 이 이외의 intron 부분에서 in/del이 일어난다고 해도 target gene에 영향을 주지 않을 확률이 상당히 높습니다. 그리고 처음에 말씀드렸듯이, CRISPR KO의 가장 큰 목적은 exon 내에 frameshift를 야기하는 것입니다. intron 부분은 아예 안 넣으시는 걸 추천합니다.
우선 위에 의심되는 부분들에서도 크게 문제가 없었다는 가정 하에 질문에 답변을 드리자면...
1. 질문자가 targeting한 위치보다 antibody가 binding하는 위치가 더 N-terminal 쪽에 위치한다면 당연히 그 antibody로는 확인이 불가능합니다. (왜인지는 설명 안 해도 이제 아시겠지요? ^^)
2. 만약 target gene이 cell viability에 매우 중요한 역할을 해서 knock out 된 cell들이 이미 다 죽어버렸을 가능성도 있습니다. (qPCR 확인 - cell 다 죽음 - western blot 확인) 이 경우에는, knockout 된 cell 들을 다시 한 번 DNA sequencing을 해보면 쉽게 확인할 수 있겠네요.
사족으로 몇 자 더 추가하자면,
CRISPR을 이용해서 knockout 시켰다 하더라도 100% KO이 되는 것은 아닙니다. 정상적으로 knockout 되었다 예상되는 cell들에서 western blot을 해 보아도 약~간의 밴드가 보일 수 있습니다. 왜 그런지는 조금 생각해보시면 쉽게 답을 아실 수 있을거에요.
제가 전문가는 아닙니다만, 제 후배에게 가르쳐준다고 생각하고 제 지식 수준 하에서 열심히 적어봤습니다. 뭔가 얻어갈 수 있는 시간이었으면 좋겠네요.