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 전체 > Molecular Biology-RNA > mRNA Analysis
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질문 real-time PCR실험과 RT-PCR에 대해서 질문합니다.
알하핳(대학원생)  |  2019.04.17 22:30

 안녕하세요.

석사과정중인 학생입니다. 실험을 하다가 계속해서 같은 문제가 반복 되는데 도저히 제 수준에서는 답을 찾을 수 없어 도움을 받고자 글을 올립니다.

세포에서 total RNA를 추출하고 cDNA를 합성하여 RT-PCR을 해서 전기영동으로 gene의 발현양을 확인하였습니다. 

원하는 패턴이 확인되어 같은 cDNA로 real-time PCR로 confirm실험을 진행하였으나 RT-PCR과는 다르게 모든 sample의 Ct값이 소수점 자리정도의 차이만 있지 거의 비슷합니다.

RNA의 purity에도 문제가 없었고, real-time과정에서 melting curve도  one peak로 나왔고, triple로 진행한 sample의 variation도 크지 않은데  어떤 부분에 문제가 있는 건지 아무리 찾아보고 같은 실험실에 계신 선생님들께 여쭈어 보아도 답을 알 수 가 없네요...

 

질문을 요약하자면 RT-PCR과 real-time PCR의 결과가 다르게 나오는 경우 원인에는 어떤 것들이 있을 수 있는지,

그게 아니면 real-time PCR시 sample간의 Ct값이 다 비슷한 경우 gene발현 양이 실제로 차이가 없다는 것 외에 다른 이유가 있을 수 있는지 알고싶습니다.

비슷한 경험이 있으시거나 짐작되는 원인이 있으시면 어떤 것이든 댓글 부탁드립니다.

귀한시간내어서 읽어주셔서 감사합니다.   

#real-time PCR
 
#RT-PCR
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
대왕개구리SPEED  |  2019.04.17   

1. 1개의 RNA 시료로 부터 일부는 RT-PCR, 일부는 qPCR했습니까?

2. 그리고 RT-PCR에서 cDNA 합성 후 target 증폭시 몇 cycles을 했나요?

3. RT-PCR시 control도 같이 증폭해서 sample간 loading양은 보정했나요?

알하핳  |  2019.04.17   
1. 네 맞습니다. 하나의 sample로 rt-PCR과 qPCR을 했습니다.

2. RT-PCR의 경우 각 target 마다 saturation 되지 않는 cycle로 진행하였습니다. 예를 들어 gapdh같은 경우는 21cy로 진행하였고 다른 target gene들은 각각 26cy 25cy 30cy 로 진행하였습니다. 같은 target을 qPCR한 결과 Ct 값이 gapdh는 19정도로 나왔고 다른 타켓들 약시 RT와 비슷한 값인 27, 24, 28정도의 수준으로 나왔습니다.

3. 같은 sample의 gapdh의 발현양으로 값을 보정하였습니다.
대왕개구리SPEED  |  2019.04.17   

RT에서 control과 sample모두 22~25cycles 안에서 동일하게 해보세요..

모든 sample은 cycles이 동일하게 해야합니다.

왜냐하면 처음에는 시료내 존재하는 모든 유전자의 copy number를 모르기

때문에 임의로 시료 간 cycles을 조정 할 수가 없습니다.

알하핳  |  2019.04.18   
빠른 답변 정말 감사합니다.
그런데 1번 질문을 제가 잘못 이해하고 답을 한거같네요. RT와 qPCR의 시료가 같은 것이냐는 뜻인 줄 알고 두개가 같은 시료라는 뜻으로 말씀 드린 것이고 한 세트의 샘플 수는 4개 입니다. cycle 수는 target gene마다 달리 한 것이지 RT시 한 target내에서 sample간의 cycle차이는 두지 않았습니다.
문제는 RT에서 감소되거나 증가되었던 target gene들이 qPCR결과에서는 sample 간에 전혀 차이가 없이 나왔다는 것입니다.
대왕개구리SPEED  |  2019.04.18   

RT에서 t1. t2. t3의 발현양을 비교하는 것이라면 모두 25cyc 보다

낮은 cyc에서 동일 cycles로 확인해야 할것 같습니다.

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