1. GAPDH primer sequence, forward & reverse?
2.1. GAPDH primer designed for cDNA: gene expression of GAPDH in mRNA/total RNA isolated from tissues or cells
2.2. GAPDH primer designed for genomic DNA: presence of GAPDH genomic DNA in the tissue of interest such as tail piece or ear for genotyping (You do not use genomic DNA with GAPDH primer, usually, unless you have a transgenic mouse or animal model with GAPDH gene KO or GAPDH gene overexpressioin (knockin) etc...
3. What is the temperature you referred to? " Annealing temperature " for PCR? How did you design your GAPDH primer? There is a formula to analytically estimate the Tm or annealing temperature for PCR (See the appendix page of Qiagen PCR kit or similar ones, if you have).
Overall impression: Who is your boss? Your boss has no idea about what you do. Therefore, you have no idea what the purpose of your PCR is.
Take home message: Ask your boss 1) Is it RT-PCR (for gene expression in the tissue or cell)? or 2) Is it PCR for genotyping?
(추가답변) "...cDNA의 정의가 뭐더라? RNA를 상보한다는 뜻 아니던가? cDNA의 "c"는 complementary. 예를 들어보자.
1. aaactcctggctgactttc 라는 DNA sequence가 있다 치자 (꼬리에서 추출한 지노믹 디엔에이). 당신의 primer (forward)가 만일 위 시퀀스를 6번째 시퀀스부터 디텍하도록 설계 되었다면 프라이머 시퀀스스는 5'-cctggctgactttc ** 가 될 것.
2. 상기 시퀀스의 mRNA 시퀀스는 어떻게 될까?
tttgaggaccgactgaaag 가 아닐까? 아니지. RNA는 T대신 U! therefore,
uuugaggaccgacugaaag 라는 시퀀스가 해당 RNA 시퀀스 일 것. 이것을 검출하는 primer (forward)는 어떻게 될 것인가? 당신의 primer (forward)가 만일 위 시퀀스를 6번째 시퀀스부터 디텍하도록 설계 되었다면 프라이머 시퀀스스는 5'-ggaccgactgaa *** 가 될 것.
3. 자, 이제 ** 와 ***의 시퀀스를 비교해보자.
**라는 프라이머 시퀀스 (포워드) 5'-cctggctgactttc
***라는 프라이머시퀀스(포워드) 5'-ggaccgactgaa
결론. 님의 프라이머는 GAPDH 프라이머 하나 있습니다 (포워드+리버스가 합쳐짐). 어떤 목적이냐에 따라 검출하는 시퀀스가 달라요. cDNA와 genomic DNA는 서로 다른 두 개의 목적을 가지고 있어요.
님의 프라이머는 서로 다른 두개의 목적에 맞게 서로 다른 두 개가 되든지, 아니면, 둘 중 하나만 검출하도록 설계되어 있는게 맞습니다. 님의 실험실에 GAPDH primer는 mRNA expression을 검출하도록 설계된 것일 확률이 95% 입니다. 따라서, 지노타이핑에 쓰면 아무것도 검출 안되는 것이 맞습니다.
(내가 답을 써놓고도 헷갈리네. 지노타이핑 1000번 넘게 해도 답변 주려니 또 헷갈린다. 암튼, 나 같으면, GAPDH primer는 지노타이핑에 안 쓰거나 진익스프레션 스타디에만 쓸 것 같다)
-
DTer
(비회원)
-
19.04.05 17:54
실험은 뚜렷한 이유도 없이 많은 조건으로 혹은 열심히 하는 것보다 제대로 정확히 하는 것이 중요합니다. 찢어지고 지저분한 전기영동 사진 하나가 여러 가지 얘기를 하고 있습니다.
PCR에서 가장 중요한 3가지 요소는 template, primer set, PCR reagent & condition인데, 굉장히 희귀한 유전자이거나 PCR이 까다로운 경우가 아니면 세번째 조건은 일반적인 kit과 조건을 사용하면 크게 문제가 되지 않습니다.
그럼 첫번째 template, 클로닝할 때 cDNA를 사용하는 이유는 진핵 유전자가 exon-intron-exon--- 구조로, 실제 단백질을 만드는 유전자가 intron에 의해 끊어져 있기 때문에 하나의 유전자로 연결시킨 mRNA를 분리하여 cDNA를 합성하면 PCR template가 될 수 있습니다. Genomic DNA는 cDNA와 마찬가지로 DNA이긴 하지만 intron에 의해 불연속적으로 되어 있어 구조적으로 다릅니다. 사진에서 cDNA를 template로 사용한 경우는, cDNA로 추정되는 것이 보일 정도로 많은 template를 사용한 것으로 보임. genomic DNA를 template로 사용한 경우라 주장하는 것은, 사실인지는 모르겠지만 rRNA로 보이는 밴드와 RNA가 분해되면 보이는 저분자가 보임. Total RNA를 분리한 것을 genomic DNA라고 하지 않았나 의심됨. 요약하면, template를 지나치게 많이 부적절하게 사용한 것으로 추정됨.
두번째 primer set, 어떤 유전자의 어떤 primer인지는 모르겠지만 논문 등에서 검증된 것인지 확인이 필요함. primer의 경우, cDNA와 genomic DNA에 공통으로 사용할 수 있는 경우와 없는 경우가 있음. 가능한 경우는 한쌍의 primer 모두 exon에 포함된 경우임. 불가능한 경우는 primer는 cDNA 증폭에 적합할 것이므로, primer 한쌍 중 하나라도 genomic DNA의 분리된 exon에 걸쳐져 있는 경우는 genomic DNA를 template로 사용하면 PCR이 될 수 없음. cDNA primer는 대부분 후자인 경우가 많아 상호 호환 불가.
이러한 사항을 전반적으로 검토한 후, cDNA를 지금보다 10배 정도는 희석하여 소량 (1 ul)만 사용하여 가장 일반적인 PCR 조건으로 재실험할 것을 추천드립니다.