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 전체 > Molecular Biology-DNA > PCR/RT-PCR/Q-PCR
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질문 PCR시 pippeting 방법에 대해
알riz(일반인)  |  03.26 22:53

 

PCR실험을 하고 있는 학생입니다.

Real Time PCR시 같은 조건에서 3반복을 해도 항상 결과가

다르게 나와요. 오차 범위가 작을때도 있지만 클때가 많습니다.

pippeting문제인 것 같은데

저는 보통 피펫을 눌렀을때  처음 지점에서 멈추고 용액을 따서

넣고 하는데 잘못 된건가요?

Mastermix, DNA 다 처음 지점까지만 누르고 몇번 pippeting한 뒤

각 tube에 넣는데 이렇게 하지 않고

mastermix나 DNA나 2번째 지점까지 꾹 눌러서 다 빼줘야 하나요?

그렇게 되면 동일양이 들어가지 못할까봐 이렇게 하고 있었거든요..

실험 고수님들 알려주세요... 

#pippeting
 
#파이펫
 
#피펫
답변하기
답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
파이펫팅은 한 번 눌러서 넣는 방식이 맞는거에요
qPCR은 만약 Taqman방식이라면 시료 비용이 높기에보통 mixture 여분을 1개분으로 잡는데
혹시 본인 손이 아직 실험에 익숙하지 않다고 생각된다면
여분을 1개가 아니라 2~3개 정도로 해서
각 튜브에 넣기 전 총양을 늘려서 오차를 줄이세요
그리고 파이펫팅 연습은 파라필름 위에서
점도가 있는 로딩다이를 1ul씩 소분해보면
연습도 되고 본인 실력도 알 수 있어요~
개구리Q.E.D.  |  03.26 23:54  

파이펫이란 참 편리하면서도 어려운 도구입니다.

내가 파이펫팅을 하는 속도가 팁내 시료들이 내려가는 속도에 맞지 않아 잔량이라던가 오차가 발생할 수 있습니다.

최대한 천천히 파이펫팅을 해보세요~

 

개구리지나가는사람  |  03.27 00:07  

혹시, Template DNA 를 몇 ul 의 volume 으로 활용하시나요?

Template DNA 를 1ul 이하의 적은 Volume 으로 넣으면 오차가 더욱 크게 적용되므로

Template DNA volume 을 약 5ul 정도로 늘려서 pipetting 하시면 오차가 줄어들 수 있습니다.

또 RT-PCR 돌리기 전에, Tube 벽에 용액이 튀지는 않았는지, Tube 밑에 공기방울이 있지는 않는지도 확인 하시는것을 추천드립니다.

개구리Marine  |  03.27 00:38  

3 replicates을 어떻게 설계하여 하느냐에 따라 결과가 달라져요.

예. A.

1 리액션당 다음과 같이 조성된다 치자:

매스터믹스 :8.5 ul

primer: 2 ul

HzO: 8.5 ul

cDNA: 1 ul

==========

1 PCR 20 ul. 세 개 레플리킷을 할라치면 저 걸 세번 반복하여 파이페팅한다.

예. B.

한리액션당 위와 같다면 세 번 반복(레플리킷)할 것이니 이렇게 설계한다:

매스터믹스: 8.5 x 3 (rep) x 1.1 (10 % 공차를 줘서 에러를 줄임)

primer: 2 ul x 3 (rep) x 1.1

HzO: 8.5 ul x 3 (rep) x 1.1

cDNA: 1 ul x 3 (rep) x 1.1

======================

3 PCR reactions ___ ul.   이 sub-master cocktail을 20 ul 씩 파이페팅한다.

 

경우 A 와 B의 리얼타임 피씨알 시티 값을 비교하면 놀랍도록 차이날 수 있음. B의 경우는 세 번 반복한 것끼리 매우 같을 것임. 에이는 당신 손 기술에 따라 달라짐 (ㅎㅎ).

 

교본에 보면 다 이렇게 하라고 되어 있으니, 잘 살펴서 해보시길.

*** 너무 정교해서 혹은 너무 많아서, 과해서 문제인 세상 ***

 

BU  |  03.28 10:53   

quantitative-PCR 경우, DNA 량에 따라 크게 결과가 좌우되는 것이지요. 

중간에 말씀하신 분처럼, DNA template의 볼륨이 너무 작게 되어 있다면 

문제의 소지가 있습니다. DNA 농도가 파이널 10 ng 이라면 2 ng/ul 으로 만들

어서 5 ul를 넣어서 볼륨 오차를 줄일 수 있을 것입니다. 10 ng/ul 로 해서 1 ul

만 넣는 것은 추천하지 않아요 그럼 오차가 커질 수 있습니다. 그럼 뜨라블슈팅 잘해서 결과 잘 얻으시길 바랄께요~  

하루카이  |  03.31 10:43   
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