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레벨1
Q.E.D.
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19.03.26 23:54
파이펫팅은 한 번 눌러서 넣는 방식이 맞는거에요
qPCR은 만약 Taqman방식이라면 시료 비용이 높기에보통 mixture 여분을 1개분으로 잡는데
혹시 본인 손이 아직 실험에 익숙하지 않다고 생각된다면
여분을 1개가 아니라 2~3개 정도로 해서
각 튜브에 넣기 전 총양을 늘려서 오차를 줄이세요
그리고 파이펫팅 연습은 파라필름 위에서
점도가 있는 로딩다이를 1ul씩 소분해보면
연습도 되고 본인 실력도 알 수 있어요~
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레벨5
지나가는사람
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19.03.27 00:07
파이펫이란 참 편리하면서도 어려운 도구입니다.
내가 파이펫팅을 하는 속도가 팁내 시료들이 내려가는 속도에 맞지 않아 잔량이라던가 오차가 발생할 수 있습니다.
최대한 천천히 파이펫팅을 해보세요~
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레벨5
Marine
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19.03.27 00:38
혹시, Template DNA 를 몇 ul 의 volume 으로 활용하시나요?
Template DNA 를 1ul 이하의 적은 Volume 으로 넣으면 오차가 더욱 크게 적용되므로
Template DNA volume 을 약 5ul 정도로 늘려서 pipetting 하시면 오차가 줄어들 수 있습니다.
또 RT-PCR 돌리기 전에, Tube 벽에 용액이 튀지는 않았는지, Tube 밑에 공기방울이 있지는 않는지도 확인 하시는것을 추천드립니다.
3 replicates을 어떻게 설계하여 하느냐에 따라 결과가 달라져요.
예. A.
1 리액션당 다음과 같이 조성된다 치자:
매스터믹스 :8.5 ul
primer: 2 ul
HzO: 8.5 ul
cDNA: 1 ul
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1 PCR 20 ul. 세 개 레플리킷을 할라치면 저 걸 세번 반복하여 파이페팅한다.
예. B.
한리액션당 위와 같다면 세 번 반복(레플리킷)할 것이니 이렇게 설계한다:
매스터믹스: 8.5 x 3 (rep) x 1.1 (10 % 공차를 줘서 에러를 줄임)
primer: 2 ul x 3 (rep) x 1.1
HzO: 8.5 ul x 3 (rep) x 1.1
cDNA: 1 ul x 3 (rep) x 1.1
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3 PCR reactions ___ ul. 이 sub-master cocktail을 20 ul 씩 파이페팅한다.
경우 A 와 B의 리얼타임 피씨알 시티 값을 비교하면 놀랍도록 차이날 수 있음. B의 경우는 세 번 반복한 것끼리 매우 같을 것임. 에이는 당신 손 기술에 따라 달라짐 (ㅎㅎ).
교본에 보면 다 이렇게 하라고 되어 있으니, 잘 살펴서 해보시길.
*** 너무 정교해서 혹은 너무 많아서, 과해서 문제인 세상 ***
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하루카이
(비회원)
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19.03.31 10:43
quantitative-PCR 경우, DNA 량에 따라 크게 결과가 좌우되는 것이지요.
중간에 말씀하신 분처럼, DNA template의 볼륨이 너무 작게 되어 있다면
문제의 소지가 있습니다. DNA 농도가 파이널 10 ng 이라면 2 ng/ul 으로 만들
어서 5 ul를 넣어서 볼륨 오차를 줄일 수 있을 것입니다. 10 ng/ul 로 해서 1 ul
만 넣는 것은 추천하지 않아요 그럼 오차가 커질 수 있습니다. 그럼 뜨라블슈팅 잘해서 결과 잘 얻으시길 바랄께요~