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ligation에 사용하는 3차 멸균수 및 vector, insert의 정제도가 높다면
cohesive end의 경우 16도 30분, blunt end의 경우 22도 2시간 안에
95% ligation이 됩니다.
따라서 연구자 경험으로 ligation이 잘되는 조건으로 실험하면 될겁니다.
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레벨2
sing777
(대학원생)
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19.03.26 17:27
답변 감사합니다
실험 경험이 별로 없어서요.. 질문 하나 더드려도 될까요
시간이 부족하여 오늘 16도에서 20시간정도 overnight하여 ligation 하려고 하는데 시간을 오래 하면 안좋나요? 그리고 inactivation은 꼭 해야하나요? 그리고 벡터와 인서트 모두 blunt end 입니다
Blunt end는 cohesive end 보다 온도가 조금 높은 조건에서 하는 것이
좋습니다.
ligation mixture가 nuclease에 오염이 되지 않았으면 장시간 ligation 해도
DNA에 문제는 발생하지 않습니다.
온도는 22~25도가 적당하며 inactivation은 해도 / 안해도 무방합니다.
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레벨2
sing777
(대학원생)
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19.03.26 17:38
정말 감사합니다 ㅠㅠㅠ
죄송 한데 한가지만 더 여쭤볼게요...!!!!
Vector size가 8kb이고 insert가 1kb 정도인데
지금 정확한 농도는 계산이 안됩니다.
겔 영동을 통해서 확인한 결과 insert가 더 진하게 나왔는데요..
넣는 양을 어떻게 조절해야 할지 감이 안잡히네요..
1:3으로 넣고 total volume은 20ul로 하려고 하는데
넣는 양에 대해서 조언좀 부탁드립니다..ㅠㅠㅠ
일반적으로 A260에서 정량한 양으로 계산하면 되고
분자량이 v : i = 8 : 1이기 때문에
예를 들어 v 0.1ug, i 0.1ug이면 말단 비율이 insert가 8배 많습니다.
먼저 vector 양을 정하고 vector양의 0.375를 넣으면 1 : 3의 비율이 됩니다.