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- pET24ma vector(Nde1, BamH1)에 들어있는 유전자를 pETDuet vector에 넣어서 단백질
발현을 살펴보는 실험을 진행하려고 합니다.
: pETDuet은 dual ORF expression vector입니다.
왜 single expression vector를 사용하지 않고 pETDuet을 사용할 계획인가요?
- 아래에 보시다시피 Nde1은 mcs2 site에, BamH1은 mcs1 site에 존재하여 중간에 있는 T7 promoter-2나 lac operator, rbs가 사라지게 되는데 이러한 경우 괜찮은 건가요?
: MCS1의 T7 promoter + LacO + rbs를 사용하기 때문에 ORF 방향이 BamH I -> Nde I이면
발현이 가능하고 반대 방향이면 불가능하니다.
- 두번째 방법으로 BamH1이 아닌 그 뒤에 존재하는 제한효소인 Xho1을 사용하는 방법도
있는데 이 방법의 경우 BamH1 뒤부터 Xho1 까지 불필요한 peptide가 발현되는 문제가
발생하게 됩니다.
그리고 BamH I -> Xho I 방향도 발현 가능하며 Nde I -> Xho I 방향도 발현 가능합니다.
ORF 방향만 맞으면 두 방법 모두 사용가능합니다.
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레벨1
dkdkdkdk
(대학원생)
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19.03.26 00:58
답변 정말 감사합니다.
제가 duet vector를 선택한 이유는 cloning을 완성 후, 동일 vector에 한 가지 유전자를 더 넣을 계획이 있기 때문입니다.
2개 ORF를 넣으려면 처음부터 다시 디자인 해야할 겁니다. 첫번째 방법으로 첫번째 ORF를 클로닝하면 두번째 ORF를 넣기가 힘들어 질수도 있고 경우에 따라 발현이 안될수도 있기 때문에 두번째 빙법으로 실험하는게 좋을듯 합니다.
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힘내세요
(비회원)
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19.03.27 03:16
적당한 제한효소가 없으면, 한쪽은 fill in 하여 blant end로 만들어 연결하는 방법도 있습니다. 그리고 다른 한쪽도 cut되고 남은 가운데 2-4개의 염기만 일치하면 연결이 됩니다. 이때는frame을 잘 맞추어서 해야합니다.
예전에 정 방법이 없을 때 쓰던 방법이긴 한데....
Partical digest하는 방법도 있습니다. 정말 최후의 수단으로 썼던 방법이었습니다.
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bio_S
(비회원)
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19.03.29 11:56
gibson assembly protocol 이용해보세요. primer 가격이 추가되지만 이런 케이스의 경우 유용합니다.
NEB의 gibson assembly Kit도 있고 국내회사인 bioneer의 Cloning Kit도 같은 방식으로 작동합니다.