저의 경우 kit를 사용한적이 없어 뭐라 답변드리기 힘들지만
그냥 mutation된 염기를 포함하는 primer를 만들어 PCR하면 쉽게 몇곳이라도
돌연변이된 유전자를 만들수가 있습니다.
PCR하실 때 쓰신 template DNA를 많이 넣으셨나요?
PCR product가 template DNA가 그대로 나온 것이라면 DpnI 처리했을 때 당연히 모두 잘리는게 맞겠지요.
SDM(site directed mutagenesis)은 스텝이 많아서 스텝별로 확인이 필요합니다..
SDM이 어렵다면 overlaping PCR로 mutagenesis해도 좋을 것 같습니다.
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레벨1
치킨삼뚝
(대학원생)
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19.03.05 17:57
kit를 사용하지만 primer도 제가 mutation을 포함시켜 디자인하였고 다른 프로토콜과 크게 다르지않다고 생각했는데 혹시 사용하시던 프로토콜이 있으신가요?
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레벨1
치킨삼뚝
(대학원생)
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19.03.05 17:58
엑스트라님 dna는 50ng사용했습니다. 프로토콜에 50ng까지 사용해도된다고 써있는데 혹시 많은양인가요?
-> <--xx--
--xx--> <-
----A-----xx---
--xx------B------
와 같이 SDM할 때 썼던 primer와 기존에 사용하던 양쪽 프라이머를 이용하여
PCR product A, B를 얻으시고, 이것을 PCR mixture로 쓰시고, 8 cycle 정도에
양쪽 프라이머를 넣어주시면 전체 product가 만들어집니다.
첨부파일 확인해주세요.
저는 template DNA는 10ng 이하를 주로 사용합니다.
X-->F
========X========
<-- R
위와 같이 Pfu로 PCR해서 바로 ligation하면 됩니다.
primer는 양쪽다 Pi를 붙여서 합성해야하고 아마 5kb정도는 Pfu로 증폭을
해본 경험이 있어 1step으로 가능할 겁니다.
만약 F 방향에 몇균데 더 mutagenesis를 해야 할 경우는 primer 길이 안에
있으면 한번의 PCR로 가능하고 거리가 떨어져 있으면 2번 PCR해야 합니다.
또 한가지 tip은
====RE-A or B======X====RE-A or B====
위의 그림같이 mutagenesis 염기 양쪽으로 1 cut하는(RE-A or B) 효소나
2 cut하는 효소가 있으면 각 효소로 잘라진 단편의 길이가 너무 길지 않은
경우 oligomer를 합성해서 바로 ligation하면 됩니다.
요즘 한번에 100bp는 합성가능하기 때문에 예를 들어 길이가 300bp정도
되면 3단편을 합성해서 in vitro에서 연결한 후 최종 vector에 연결하면
됩니다.