실험 Q&A Mol. Biol.-DNA > Gene Cloning
LIC(Ligation independent cloning)에 대한 질문입니다.
레벨1 yem (과기인)
안녕하세요. LIC방법으로 클로닝을 하려고 합니다.
우선 인서트와 벡터는 만들어놨고,다음 실험 진행 전 protocol을 정확히 숙지한 후
실험을 진행하려 합니다.
그런데 사용하려는 T4 DNA polymerase가 fermentas사의 제품인데 3'exonuclease 활성을
이용한 protocol이 없어서 질문드리려 합니다.
1. 논문의 protocol중에(논문제목-One-Step Sequence- and Ligation-Independent
Cloning as a Rapid and Versatile Cloning Method for Functional Genomics Studies)
vector와 insert를 elution할 때, TE buffer와 water는 사용하면 안되고
elution buffer 또는 10mM Tris-Cl(pH8.0~8.5)을 사용하라고 나와있는데 그 이유는
무엇인가요?
제가 찾아본 결과 TE buffer에 EDTA가 들어있어서 클로닝에 영향을 줄 수 있어서 그런
것 같은데,,elution buffer에도 EDTA가 들어있지 않나요??
pw로 elution하면 안되는 이유는 무엇인가요??
2. 그래서 10mM Tris-Cl(pH8.0~8.5)를 사용하고자 하는데요. 실험실에 1M짜리밖에 없어
서 딜루션해서 사용하려고 합니다. pH를 정확하게 맞춰서 사용해줘야 하나요?
아니면 그냥 희석한 후 써도 무방한가요?
그리고 딜루션 후 Autoclave를 돌린 후에 사용해야 하나요?
이 외에도 제가 잘 못 이해하고 있는 부분이나 추가로 알아야 할 부분이 있다면 코멘트 부탁드립니다!
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