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Microbiomics(미생물 군집 분석)시 DNA Extraction의 중요성_(Microbiomics series 3)
레벨5 A'ANE (과기인)
이전 글을 통하여 샘플 채집 단계와 Standard의 필요성에 대하여
살펴 보았다.
Microbiomics series 1 : Microbiomics분석(미생물군집분석)용 샘플채집(DNA/RNA
shield)( http://www.ibric.org/myboard/read.php?Board=exp_qna&id=624526)
Microbiomics series 2 : Microbiomics분석(미생물군집분석)용 Standard의
필요성(http://www.ibric.org/myboard/read.php?Board=exp_qna&id=634028)
이번 글에서 살펴보고자 하는 것은 DNA extraction이다. 먼저 Microbiomics실험은
Sample collection/Preservation, DNA/RNA extraction, Library preparation,
Sequencing, Bioinformatics 의 단계로 이루어진다. 각각의 단계는 모두 Bias한 결과를 낳을 소지가 있기 때문에 정확한 결과 분석 전에 정확한 실험이 먼저 이루어 져야 할 것이다. Bias란 “bias occurs when systematic error
[is] introduced into sampling or testing by selecting or encouraging one
outcome or answer over others”라고 말 할 수 있다. (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2917255)
<그림1.
Microbiomics실험 순서와 단계별 불안 요소>
이
중 이번 글에서 살펴보고자 하는 것은 DNA/RNA extraction이다. Microbiomics실험을 위하여 실험을 준비할 때 핵산 추출과정은 크게 신경 쓰지 않고 넘어갈 소지가 많다. 하지만 과연 그럴까?
Microbiomics를 쉽게 설명하면 이렇다. 예를 들어 어떤 샘플에 A, B, C, D, E 미생물이 각각 20개씩 샘플에 들어있다고 치자. 그럼 총 100%중 각 미생물이 차지하는 비율이 20%인지를 확인하고자 하는
것이다.
하지만
미생물의 생물학적 강도(Hardness)는 각각 다르기 때문에 저 5가지
미생물 핵산을 ‘균일하게’ 추출하는 것은 참으로 어렵다. 이상적으로 샘플의 모든 핵산을 모두 추출할 수 는 없다 하더라도 균일하게
DNA를 추출하는 것부터 가 올바른 분석을 위한 기초 중에 기초라고 할 수 있다.
예를
들어 A,B,C는 연약한 미생물이라 낮은 강도에서도 쉽게 Lysis되어 DNA가 추출되는 한편 D,E미생물은 쉽게 Lysis되지 않는 미생물이라면 어떨까? 핵산을 추출했는데 A,B,C는 10개어치의 핵산이,
D,E는 5개 만큼의 핵산이 추출된다면 최종 결과 분석에서 ABC미생물이 각 25% DE미생물이 각 7.5%비율로 분석이 될 것이다. 하지만 이미 이 글을 읽고 있는
분들은 알고 있다. 잘못된 결과라는 것을.
그렇다면 이 부분을 어떻게 확인하고 바로잡을 수 있을까? 먼저 이
부분을 확인하기 위해 반드시 Standard가 필요하다. 비교대상이
있어야 제대로 뽑혔는지 뽑히지 않았는지 확인할 수 있지 않은가? 또한 비교대상이 있다면 샘플 핵산을
‘균일하게’ 추출할 수 있는 방법이 필요하다. 단일 미생물 분석의 경우 샘플에서 핵산이 추출되기만 했으면 되었지만,
Microbiomics실험은 그렇지 않다. 기존 미생물 추출 제품을 획일적으로 실험에 적용하면서
‘뭐 그냥 미생물 추출 키트 아무거나 사용하면 되는 거 아닌가’ 라고
생각하면 안 되는 이유이기도 하다.
<그림2. Standard와 DNA추출 방법 별 결과 비교>
위 그림은 기존에
사용하던 HMP(human microbiomics protocol)로
Standard의 DNA를 추출하여 분석한 결과이다. 결과에서
확인할 수 있는 것처럼 상대적으로 연약한 그람 음성 균이 많은 것처럼 결과가 나왔다. 하지만 이론 값과
비교하면 잘못된 결과임을 알 수 있다.
<그림3. DNA 추출 방법 별
DNA Yeild>
<그림4. DNA추출 방법 별 Inhibitor
removal>
공든 탑을 쌓듯
다른 단계 뿐만 아니라 DNA 추출 단계 또한 항상 확인하면서 실험하는 자세가 필요할 것이다.
ZymoBIOMCIS DNA Miniprep kit (https://www.zymoresearch.com/collections/zymobiomics-dna-kits)
미생물군집분석용
샘플의 적절한 파쇄 방법에 관한 Zymo Research사와
Bertin사의 콜라보레이션 프로젝트(https://www.zymoresearch.com/blogs/press-releases/zymo-research-and-bertin-announce-new-collaboration)
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