실험 Q&A Mol. Biol.-RNA > Purification/Isolation
virus에서 RNA 추출과 RT - PCR 실험이 진행이 되지 않습니다. ㅜㅜ
레벨1 구미 (과기인)
안녕하세요 바이러스 면역학을 공부하고 있는 학부생입니다.
이번에 저의 담당 교수님께서 VHSV라는 바이러스로부터 RNA 추출 ~ sequencing을 해보라고 하셔서 실험을 진행하고 있지만
첫 RNA 추출 단계부터 실험이 제대로 진행되지가 않습니다.. ㅠㅠ
그래서 BRIC의 계시는 많은 고수님들의 도움을 여쭙기 위해 이렇게 글을 쓰게 되었어요..
먼저 RNA 추출 protocol은 아래와 같습니다
1. VHSV를 EPC cell을 배양한 t-25에 3일, 6일간 배양후 media를 거둡니다. (500ul)
2. trizol 1ml과 chloroform 300ml( ML당 200ml로 계산하여 총 300ml을 분주) 후, pippeting
3. ice에 15min incubvate 후에 12000rpm, 15min, 4℃에 원심을 돌립니다.
4. 원심이 끝난 E.P tube로부터 투명한 상층액을 거둔 뒤 isopropanol 500ul 분주 후 inverting, ice에 10min 4℃ incubate
5. 12000rpm, 15min, 4℃로 원심돌린 후 상층액을 털듯히 제거합니다.
6. pellet의 유무를 확인 후 75퍼센트 알코올(실험용) 1ml 분주 후 tapping
7. 7500rpm, 10min, 4℃ 원심분리 합니다.
8. 털듯히 상층액 제거후 DEPC water 50ul을 분주 합니다.
여기까지가 제가 찾아본 RNA 추출 protocol 입니다.
다음은 RT- PCR protocol 입니다.
1. RNA 5ul과 oligo(dt) 2ul와 함께 92℃에서 2min 동안 PCR을 돌립니다.
2. 선행 PCR을 마친 후
10x PCR buffer 3ul
dNTPs(2mM) 2ul
RT 0.5ul
oligo(dt) 2ul
MgCl(25mM) 6.0ul
DEPC water 19.5ul
을 추가적으로 분주하여 40ul로 용량을 맞춘 뒤 42℃에서 2시간 동안 PCR을 진행 합니다.
지금까지 선배님들의 노트와 구글링을 통해 알게된 protocol입니다.
제가 여쭈어보고 싶은 건 저의 실험 방법이 잘 못된 것인지의 유무와 추가적으로 궁금증이 있어서요.
RNA 추출과정에서 isopropanol을 분주, 원심분리 후에 pellet을 확인하는 과정이 있는데 저는 단 한 번도 생긴적이 없습니다. 여기서 가정할 수 있는게
1.) RNA가 추출되지 않았다 2.) RNA가 극히 적어 pellet이 안보이는 거다.
3.) ispropanol의 문제가 발생한 것이다(최소 10년 이상되었습니다.)
여기서 1번의 경우는 다른 분들의 protocol과 비교해서 문제가 될게 없다고 생각하며
2번의 경우는 BRIC에서 serching했을 때 이러한 경우도 종종 생긴다고 해서 그대로 실험을 진행했습니다.
3번은 아무래도 오래되어서 문제가 생길 수 있다라는 생각이 듭니다.
여기서 3번의 경우 ispropanol이 10년 이상의 기간에 의해서 변질이 됨에 의해서 pellet이 생기지 않을 수가 있을까요.. ?? 고수님들은 어떻게 생각하시나요..??
RT PCR에서 사용하는 buffer의 경우 reaction buffer와 조성이 비슷하여서 일반 PCR buffer을 사용했습니다 또한 다른 protocol에서도 10x PCR buffer을 사용한다는 것을 보긴 했었는데 이게 문제가 될 수 있을까요??
RT PCR condition의 경우 논문마다 각각 다르기도 해서 선택하기가 어려웠습니다.
그러다 선배님의 노트에서 위와같은 condition으로 실험을 진행한 사례가 있어서 진행을 했는데 혹시 잘못된 condition 일까요??
고수님들 잘 부탁드리겠습니다!!
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