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질문 부착세포 미디어를 갈아주면 계속 죽어요ㅠ
알red1656(대학원생)  | 2019.02.19 12:00

제가 부착세포는 처음이고 HeLa세포를 키우고 있는데 미디어 교환할때 (트립신사용 NO)살아있는 세포를 떼지 않고 죽은 세포 살짝 떼겨고 PBS로 한번 washing 후 미디어 교환해 줬는데 다음날 되면 세포가 다 뜨고 죽어요 이유를 모르겠어요(100dish기준으로 PBS10ml 사용해서 10정도 흔들었어요)

그리고 지금 stock을 만들어야 하는데 부착세포는 dish에 몆% 정도 차면 만드는게 좋을까요?? stock만드는것은 부유세포랑 방법이 같나요??


#부착세포
 
#미디어
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
대왕개구리안재진  |  2019.02.19   
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

혹시 지금 사용하는 배지를 확인해보셨나요?
FBS가 들어가 있지 않다던가 농도라던거.
아니면 본인이 생각하시는 PBS가 70% EtOH인 경우는 아니겠죠?


현재 셀배양이 잘 안되고 있기 때문에 이부분을 해결하고 스탁을 만드셔야 겠네요.
이부분은 여기보다는 youtube에서 cell freezing 을 검색하면 자세히 동영상으로 배우실수 있습니다.


마지막으로 8~90% 차면 스플릿을 합니다. 그리고 stock을 만드는 방법은 셀을 때어 내고 이후 방법은 동일합니다.

개구리DTer  |  2019.02.22   
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

세포가 떨어지는 이유를 이해하기 위해
세포 계대 배양 과정을 살펴 보면,

부착세포를 뗄 때,
먼저 배지를 제거하고 DPBS로 씻어 준 후, Trypsin을 처리하게 되는데
이때 DPBS로 씻어주지 않으면 세포가 잘 떨어지지 않습니다.

DPBS의 역할은 혈청에 포함된 Trypsin inhibitor인 anti-trypsin을 제거하고
동시에 배지에 포함된 Ca2+, Mg2+를 제거하게 되는데, Ca2+은 세포간 결합을 형성하는 tight junction에 필요합니다.

배지를 교환할 때, Ca2+/Mg2+이 포함되지 않은 DPBS로 씻어주면 세포간의 결합을 약화시켜 dish로부터 세포가 쉽게 떨어지게 하는 역할을 합니다.

이러한 문제를 줄이기 위해서는
혈청이 포함된 혹은 포함되지 않은 배지 (혈청이 비싸므로)로 가볍게 씻어 주거나
Ca2+, Mg2+이 포함된 buffer (예, HBSS) 같은 것으로 씻어 주면 세포가 떨어지는 것을 줄일 수 있습니다.

이러한 이유로 부착세포를 이용한 실험의 중간 과정에 세포를 DPBS로 씻는 것은 추천드리지 않습니다.

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