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질문 동물 혈장 2DE 실험관련 궁금한점이 있습니다.
알용햄(과기인)  | 2019.02.18 18:54
첨부파일 파일첨부: 1234.jpg (8 KB)
이미지 첨부파일

안녕하세요 2DE 왕초보입니다.
실험방법에 관련해 조건이 잡히지 않아 문의드립니다.

현재 연구소 사정상 고전적인 방법으로 2DE를 진행중입니다.
1D gel을 직접 만들어 로딩 후 로딩한 부분만 절단하여 2D로 넘어가는 방법입니다.

먼저 1D(IEF) 실험조건으로는 

- gel 조성
Urea 2.4g / 30% acrylamide 2.0ml / 50% glycerol 2.4ml / DW 2.4ml
4-6 ampholyte 550ul / 3-10 ampholyte 50ul / APS 50ul / TEMED 20ul 
으로 겔을 만들어 
동물혈장과 2X sample buffer 를 1:1비율로 섞은 후 20ul / 40ul 로딩하였습니다.

문제는 50 / 100 / 150 / 200 / 250 / 300V 각각 30분씩 로딩 후 최종적으로 
300V에서 6시간 가량 로딩하는게 제가받은 프로토콜인데 

첫날은 결과는 잘 안나왔지만 300V에서 6시간 가량 로딩이 되었습니다. 

어느순간부터 power supply가 200V 이상 올라가면 저항이 걸려 계속 shut down이 되었습니다. (power supply : BIORAD power pac 3000)

처음에는 upper buffer / tank buffer 등 모든 버퍼의 3차증류수가 문제일거라 판단이되어
3차증류수도 교체하였지만 마찬가지로 200V 이상 올라가지 않았습니다.

Sample의 양에 문제가 있을거라 생각하기도 하여 희석을 100~300배 가량 해보았지만 역시나 저항이 걸려 power supply가 shut down이 되었습니다.

사진에 gel은 2D까지 완료한 상태이고 왼쪽으로부터 pI 값이 3-10 입니다.

어떠한 조건으로 해도 한달가량 지금사진의 gel처럼 나옵니다.

어떻게 조건을 다시잡아야 할까요 ... ? 

조언좀 부탁드리겠습니다 !



#IEF
 
#2DE
 
#proteomics
답변하기
답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
대왕개구리SPEED  |  2019.02.18   
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.
시료가 혈장인가요 혈청인가요?

1D gel을 만드는 조건을 다시 찾아보세요..

pI 별 분리가 정확히 되지 않았습니다.

알용햄  |  2019.02.18   

시료는 동물 혈장입니다.

그럼 1D gel의 조성문제 때문에 power supply가 200V 이상 안올라갈수도 있는건가요 ??

대왕개구리SPEED  |  2019.02.18   
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

shut down 문제는 장비를 확인해 보는게 좋을 듯하구요..

1D gel 조성은 현재 시료의 pI 별 분리가 많이 안되었습니다.

따라서 1D gel을 최적화 해야지 좀더 2D spot 분리가 잘될듯 합니다.

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