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본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
A. ligation 효율 확인
1. enzyme uncut vector
2. enzyme cut vector(single enzyme)
3. enzyme cut and ligation vector
위의 1, 2, 3을 TF해서 colony를 비교하면 ligation 반응이 정상적으로 되는지 확인 가능
1이 100개가 나온다면 2는 5개 이하 3은 95개 이상이 나오면 좋습니다.
B. cloning 효율
1. enzyme uncut vector
2. 2 enzyme cut vector TF
3. 2번 vector self ligation
4. verctor + insert ligation
1의 colony가 100개 나온다면 2의 colony는 5개 이하가 나오면 안잘린 vector가 5%이하
이며 3번의 colony가 5개 이하면 1 cut된 vector가 5% 이하.
ligation 효율이 95%이상 그리고 95% 이상 2 cut된 vector가 존재할 경우 V : I = 1 : 3
비율로 ligation 시키면 positive clone을 찾을 수 있습니다.
그리고 C.P cell 효율은 1ug plasmid를 TF 했을 경우 최소 1X10^6 이상만 나오면
실험에 사용가능합니다.
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레벨5
kakaoblack99
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19.02.18 14:16
cloning이란게 이론적으로는 되게 쉬운데,
막상 해보면 생각처럼 잘 안되는 실험 기법이라고 하더라구요ㅎㅎ..
일반적인 V : I optimal 비율이 1 : 3 이라고는 하나
Insert size에 따라서도 달라질 수 있고,
vector의 self-ligation은 거의 안 되는 듯 하니,
V : I 비율을 1:9. 1: 15 이런식으로 늘려가면서 진행해보세요.
또 ligation temperature condition도 일반적으로 16도에서 overnight이 최적이긴하나,
25도, 37도 에서 2-3시간으로도 진행해보시는게 좋을 듯 합니다.
추가적으로, vector에 self-ligation을 막으려고 enzyme digestion 이 후에 CIP라고 하는 enzyme을 추가적으로 넣어주기도 합니다.
뭔지는 찾아보시면 금방 아실 수 있을꺼예요.
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레벨2
Leeboratory
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19.02.18 16:49
안녕하세요.
클로닝이 진짜 말처럼 되지 않는 고통의 연속인데..고생이 많으십니다..
진행하시는데에 다른 프로토콜과 크게 다른 점은 없는 것으로 보입니다.
그저 제 경험상, com.cell과 plasmid DNA의 양이 어떻게 되는지가 영향을 미치는 것 같습니다.
보통 plasmid DNA 10uL에 com.cell 100uL(구입해서 사용하는 경우) 이런식으로 넣는데, pDNA가 생각보다 toxic 하게 느껴질 때가 많더라구요..
com.cell은 고정해두시고 pDNA 양을 반으로 줄여서 해보시는 것도 추천드립니다.
그리고 insert와 vector의 비율은 조금 찾아보시면 물질량대비를 구해서 하실 수 있을 거에요~ (insert와 vector 사이즈에 따라 볼륨으로 1:3으로 딱 정해지는게 아니라 요구하는 DNA "양"의 비율이 1:3이 되게 됩니다. addgene 혹은 takara 같은 업체 사이트 같은 곳에도 찾아보면 정보가 많으니 참고하시면 좋아요!)
힘내세요! 아주 작은 변화로도 갑자기 콜로니가 왕왕 나오기도 합니다.
좋은 결과 있으시길 바래요:)
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Ligation
(비회원)
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19.02.20 14:13
가장 큰 원인으로 생각되는 것은
ligation이 되지 않거나, ligase 활성이 매우 낮은 가능성.
원인을 차근차근 찾아 보는 것도 중요하며
첫번째로 Ligase 혹은 ligation kit을 새것으로 바꿔 진행해 보는 것을 추천 드림.
Ligation관련하여
Ligase는 50% glycerol로 되어 있으므로
전체 부피에서 ligase 첨가량이 10%를 넘지 않게 함.
초과시 glycerol로 밀도로 인해 ligation이 잘 되지 않음.
Vector:Insert 비율은 일반적으로 1:3을 사용하나
이 비율은 양의 개념이 아니라 몰 비 개념으로, vector 1개에 insert 3개 개념임.
vector가 3 kb이고, insert가 1 kb라면
vector 50 ng: insert 50 ng (1/3 크기이므로 동량일 때 몰 비로 3배가 되므로)
비율을 맞춰 주기 위해서는
Gel purification 후 260 nm에서 정량하고
정량값을 기준으로 몰 비로 1:3을 기본으로 하되
insert가 크면, insert의 비율을 오히려 낮춰서 V:I=1:1 정도로도 사용
요약하면, V:I 비율이 문제가 될 것으로 생각되면
V:I 비율을 1:1, 1:2, 1:3 정도로 달리한 반응을 동시에 진행해 보는 것 추천 드림.
Vector의 양도 일반적으로 50 ng정도에서 시작하나
100 ng정도 사용하고 비율을 맞춰 주는 것도 한 방법이며,
Transformation도 그 중 소량만 사용하도록 되어 있는데
다양한 이유로 효율이 낮다면
배양 (1 ml 기준) 후 그 중 1/10 (100 ul)은 그대로 plating하고
나머지 전부를 원심분리한 후 배지 800 ul를 제거하고 나머지 100 ul에 현탁하여
plating하는 방법 추천.
Transformation시 배지로 희석하여 배양하는 경우
Competent cell에 들어 있는 DMSO를 희석하는 개념이 포함되므로
배지는 10배 희석하는 비율로 해 주는 것이 필요.