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 전체 > Molecular Biology-DNA > PCR/RT-PCR/Q-PCR
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질문 PCR band가 멀티밴드가 뜹니다.
뒷다리아이브릭(대학생)  | 2019.02.15 14:15
첨부파일 파일첨부: band(좌,우 동일한 샘플).png (113 KB)
이미지 첨부파일


PCR band 위치는 맞는데 자꾸 멀티밴드가 뜹니다.



총 8개 정도의 유전자에서 3개의 유전자만 자꾸 이러니 답답합니다.
NCBI에서 많이 발현하는 조직부분을 찾아서 해당 조직의 gradient PCR을 진행해 64C정도에서 one band를 확인하였고,
이후 실험할 조직에 다시 진행해보니 multiband가 뜨네요..




Gradient PCR을 진행해보기도 하고 primer를 타논문에서 확인하여 다시 제작했는데도 계속 이러네요...

house keeping gene으로 rpl7을 했을 때 매번 같은 양을 로딩해도 문제없이 동일하게 잘 나오는데 왜 이럴까요...


같은 조건에서 다시 했을 때에 오히려 밴드 수가 더 늘기도 하구요. 사진으로 첨부한 피일이 그 예입니다.




이럴 경우에는 어떻게 조건을 변경해야 하나요?


확인 부탁드립니다!

#PCR
 
#band
 
#gradient PCR
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
대왕개구리안재진  |  2019.02.15   

이런경우 가장 큰 원인은 프라이머의 특이도가 떨어져서 겠죠
다른 지역을 프라이머로 짠다든가 혹은 시퀀스를 몇개 더 달아준다 하면 좋아 질수 있습니다.
저는 마지막에 A나 T로 끝났다면 C나 G까지 시퀀스를 몇개 더 늘려 주는 방법을 주로 이용합니다. 혹은 다른 지역을 짜죠

혹은 PCR 조건도 있을수 있는데 특이적으로 온도가 너무 낮은 조건은 아니기에 이 부분은 아닐거라 생각도 드네요

뒷다리him  |  2019.02.15   
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

타논문에서 이용한 primer가 좋은 primer가 아닐 수 있습니다. 

저도 reference에 있는 primer랑 직접 제작한 primer를 동시에 돌려서 비교해보면
reference primer에 의한 결과가 썩 좋지는 않더라구요.


그리고 그냥 RT PCR돌려서 band 확인 말고, real-time RT PCR로 melting curve를 확인해보셨는지요


melting curve가 몇개가 뜨는지, 어느 위치에 뜨는지에 따라서 실제 primer에 의한 유전자증폭인지, primer끼리의 결합인지 확인할 수 있을 것같아요.

대왕개구리SPEED  |  2019.02.15   
왼쪽 사진도 자세히 보면 band가 여러개 보입니다.

혹시 primer가 몇mer인가요?

뒷다리아이브릭  |  2019.02.15   
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

답변해 주신 분들 모두 감사드립니다.


안재진 / 안 나오는 부분은 각기 다른 논문을 두 개를 참고하여 primer를 사용하였기에 또 주문하기가 염려됩니다.. 현재 할 수 있는 만큼 해 보고, 안 된다면 다시 주문을 해 볼까 생각중입니다.


him / 실험실 내에서 real-time RT PCR을 사용할 때, multi band가 뜨지 않는 primer만을 사용하고 있습니다. multi band가 뜨더라도 사용해도 되나요?


SPEED / primer는 대략 20~22mer가 되도록 짜여 있습니다.

대왕개구리SPEED  |  2019.02.15   

Max 30mer 정도 디자인하면 개선되지 않을까 합니다.

꽃개구리Applied_Microbe  |  2019.02.15   

primer design을 앞뒤로 조금씩 조절해보시는 것도 도움이 됩니다. Master mix나 premix를 사용하신다면.... manual 형태로 Mg농도를 조절해보는 방법도 있긴 합니다

뒷다리아이브릭  |  2019.02.27   
답변해주신 분들 모두 감사합니다!
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