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 전체 > Molecular Biology-Protein > Western Blot Analysis
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질문 Exosome isolation후 Western blot 진행과정 문의드려요.
올챙이엔지에스(대학원생)  |  02.11 13:12
안녕하세요, 추워지는 날씨에 감기 조심하시구요!

다름이아니라 Cell culture media에서 Exosome isolation을 진행하고, Western blot을 했을때 항체가 detect가 되지않아 문의드립니다.

실험실에 혼자고 첫 과제를 받았는데 막막하네요ㅠㅠ

우선 cell line은 A549, MDA-MB-231을 이용했고, 처음에는 FPS가 들어간 RPMI에 배양하면서 plate에 90% 정도 자랐을때, PBS로 2번 Washing후 dFBS가 들어간 RPMI로 갈아주고, 24h 배양후 invi~ 회사의 Exosome isolation kit를 이용하여 추출했습니다.

추출한 exosome을 그대로 Non-reducing bf와 mix하여 100도에 5분 -> ICE로 이동해서 Western을 진행했을때 나오지 않았고, 추출한 exosome(50uL)을 RIPA bf 1x (50uL)와 protein inhibitor cocktail 1000:1 (0.5uL)로 mix 후 sonicator (2초 -> ice 1분)x3 진행해서 Lysate를 만들어서 4x Non reducing bf와 희석하여 100도에 5분-> ICE로 이동해서 똑같이 진행해도 나오지 않습니다..

항체는 ABc~ 회사 CD63, 81, 9를 이용하고 있고, 항체는 Mouse form이구요..

Running(180v, 30~40min)할때 밴드가 넓게 퍼져서 내려오더라구요..그리고 마지막에 보면 Band가 끌리듯 내려온게 보이구요..Transfer는 10V에 15min 했는데 뒷패드까지 조금 넘어가는게 보입니다.
전에 사용했던 사람은 17v에 40min 했다고 하는데...저는 낮춰서해도 넘어가네요..

실험과정에 문제가 있는건지 아니면 sample 준비부터 문제가 있는건지 잘 모르겠습니다..

control을 잡지 못해서, FBS에서 추출한 exosome을 걸고 있는데 control에도 detection이 되질 않습니다..

어디에 문제가 있는걸까요ㅠㅠ
논문 찾아보면서 혼자하는데 제대로 하는지 모르겠네요..기계 사용법 또한..
부탁드립니다!



#exosome
 
#western blot
 
#protein
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채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.
첨부파일 파일첨부: western blot.pdf (588 KB)

같은 방법으로 했었을 때 전 사람의 경우에는 나왔었던거라면
현재 본인이 하고 있는것과 뭐가 달라졌는지 확인해보세요.
웨스턴블랏 버퍼를 바꿨다면 만드는 과정에서 실수 했을 수도 있으니 다시 만들어보는것도 좋구요. 
transfer하고 나서 ponceau s staining 해보세요. 폰슈염색해서 transfer가 되는것이 확인되면 antibody 문제인거고, transfer가 안된거라면 그 전 단계에서 trouble shooting을 할 수 있어요. trouble shooting하기 좋을 거에요.
그리고 transfer시 뒷패드로 조금 넘어가는경우는 큰 문제는 되지 않습니다. 뒤로 넘어가도 멤브레인에서 다 빠져나가는건 아니니깐요. 작은 size의 경우 원래 잘 넘어가긴 합니다. 그렇다고 쉽게 다 빠져나가지도 않아요.

일단은 지금 단계에서 확인해볼만한건 폰슈염색해서 문제의 과정이 어디인지 확인해보는게 좋을거 같네요.
밴드가 끌리는 문제는 voltage를 낮추면 완화할 수 있습니다.


웨스턴블랏에 대해 정리해놓은 파일 첨부해드렸습니다. 찬찬히 보고 실험하는데 참고하시길 바랍니다.

뒷다리아이스티  |  02.12 13:31  
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