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질문 특정 gene knockout된 primary cell의 RNA-seq결과..
알yhi(대학원생)  |  2019.02.08 10:03
안녕하세요.

특정 gene A의 exon1에 neo casette가 들어가서 gene이 knockout된 마우스(+/-)에서 뽑은 세포에서 RNA를 뽑아 RNA-seq을 해보았습니다.
시퀀싱 결과, 당연히 정상군에 비해 +/-에서 특정 gene A가 낮게 발현될 줄 알았는데, 정상군과 큰 차이가 없는 것을 확인하였습니다. 시퀀싱 진행하기 전에 qPCR로 해당gene의 발현량을 확인하였는데, 그때는 정상에비해 +/-에서 절반수준으로 낮게 발현하는 것을 확인하였습니다.
시퀀싱 결과상에서는 qPCR에서 나타났던 경향성조차 나타나지않는 것 같습니다. 
어떤 이유로 그럴 수있는건지 조언 부탁드립니다..ㅜㅜ


#RNA seq
 
#qPCR
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
대왕개구리SPEED  |  2019.02.08   

특정 gene의 발현양은 qPCR 또는 northern blot 등과 같이 mRNA의 양을 측정 가능한

방법으로 확인해야 합니다.

RNA-seq.는 seq. 방법인데 발현양을 어떤방법으로 측정가능한가요?

개구리엑스트라  |  2019.02.08   
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

casette를 넣어서 gene knockout될 경우라도, 해당 gene의 프로모터는 그대로이기 때문에 동일하게 발현됩니다.

그래서 RNA level은 같을겁니다. 일단 만들어진 RNA가 casette가 같이 있는 상태로 transcription되었을 것이고요.


RNA-seq에서 쓰였던 probe가 knockout되는 지점의 것을 쓰지 않은 것 같고,
QPCR에서 쓰인 프라이머는 knockout된 지점 사이에 PCR product가 생길 경우 경향이 틀려질 수 있죠.


RNA-seq, QPCR로 하지 마시고,

Protein level에서 WB, ELISA 혹은 functional study로 knock-out된 것을 확인하세요.

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