실험 Q&A Plant Biology > Transformation
Electroporation용 Competent cell 제작
레벨1 리노 (과기인)
선배님들 안녕하십니까
현재 학부1학년을 마치고 실험실에 들어와 아는 것은 없지만 열심히 노력하고 있는 학생입니다.
교수님께서 18년도 2학기에 오신분이라 저와 같이 실험실 세팅을 해왔고, 거의 다 구축을 했는데 Elcetroporation만 애매한 상태입니다. 기계의 기본 설정값으로 여러 번 조건(healing or cuvette의 크기)를 바꿔보며, colony가 나오게 하는데 성공 했고, miniprep 후 Enzyme cut으로 전기영동까지 하여 제가 넣었던 Plasmid가 맞다는 것을 확인했습니다.
문제는 실험을 하며 날짜가 지날수록 그 다음 실험에서는 colony의 수가 적어진다는 것입니다. 제 생각으로는 Competent Cell에 문제가 있는 것 같은데 제 protocol이 맞는지 확인해주시면 감사하겠습니다.
E.coli Com.Cell - DH5a
1. LB Broth 50ml에 1%접종하여 7시간 성장 후, 50ml tube에 23ml씩 나눠담고 Centrifuge 3000rpm, 5min
2. 상층액 버리고 autoclave한 3차 증류수 30ml 넣은 후 Centrifuge 3000rpm, 5min으로 washing
3. 2번과정을 4번더 한다.
4. 상층액 버리고 각 tube에 3ml의 autoclave한 3차 증류수 넣고 살살 resuspension 후 2개의 tube를 합치고 e.p tube에 100ul씩 넣고 -80도에 보관
이렇게 만든 Com .Cell을 사용하는데요. 제가 생각한 것은 혹시나 각각 3ml의 autoclave한 3차 증류수를 넣어서 E.coli가 -80도에서 시간이 지나서 죽지는 않았나입니다.
Heat shock transformation용 Competent Cell을 만들때에는 15%glycerol을 넣었었는데, 이것도 Glycerol을 넣어야할까요?
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