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어음...
(비회원)
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19.02.06 12:36
일단 웨스턴블랏인데 염색을 해서 밴드가 나왔다는게 이해가 가지 않네요...
Tubulin 1차 항체를 가지고 staining을 하셔서 형광현미경으로 보신건지
아니면 tubulin 1차 항체를 필름에 detection 해서 band가 보였다는건지
아님 coomassie blue staining하신건지...
암튼 본래 ponceau s 는 트랜스퍼가 잘 되었는지 확인하는 용도 입니다. 그리고 ponceau s 자체가 감도가 좋지않습니다.. 10ug이하는 스테이닝해도 보이지않을수도 있습니다. 아니면은 ponceau s solution을 다시 만들어서 스테이닝해보세요. 그리고 애초 positive control도 똑같이 7ug을 로딩했어야 글쓴이 분의 샘플과 비교가능합니다 내샘플이 잘못된건지 아니면 ponceau s가 잘못된거지...
단백질 양이 적어서 안나오는거 같습니다.
아니면 fresh한 폰슈로 한번 해보세요.
Ponceau의 감도 때문인 것 같습니다.
그리고 혹시 western blotting 후에 staining 하셨는지요?
Blocking 이후에 staining하면 백그라운드도 같이 염색이 되기 때문에 단백질 밴드들이 상대적으로 잘 보이지 않습니다.
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레벨2
연연
(대학원생)
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19.02.07 06:59
Transfer를 한 후에 Tubulin으로 staining을 해서 밴드가 떳습니다 (모든밴드가 뜨지 않아서 문제입니다). 저도 이상한 점이 ponceau s로 염색이 않되는데 밴드가 뜬다는 점입니다. RIPA 버퍼를 받아서 사용을 했는데 혹시 RIPA가 오래되면 문제가 생길 수도 있는건가요?
모든밴드가 안뜰수도있어요;; 위에서 계속말했다시피 ponceau s 자체가 그리 감도가 좋은편이 아니에요...그래서 로딩양에따라 보고자하는 protein size에 따라 ponceau s로 아무리 staining해도 보이지 않을수가 있어요.
RIPA가 오래되면 안좋을거 같습니다.
새로운 RIPA로 다시 해보시는 것도 괜찮을거 같네요.
L갈갈절이
RIPA랑 ponceau S의 결과와는 어떠한 연관도 없습니다.