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전기영동 결과만 보면 A, B, C 모두 원하는 PCR 증폭이 되지 않았습니다.
원인은 여러가지가 있겠지만 먼저 primer와 template DNA가 정확한지 확인해 보는것이
좋을 듯합니다.
B의 band는 비특이적 증폭 product라고 봐야하지 않을까요?
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레벨4
뷰냐
(과기인)
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19.02.01 19:43
Speed님 >> 답변 감사드립니다.
제가 다른 선생님 cDNA template(정상인게 확인된) 로도 해봤는데 이 경우도 안나오네요. 다만 셀라인은 다르고 생물종은 같은 주형입니다.
그렇다면 프라이머 문제라고 보는 것이 맞을지요? 논문의 것을 그대로 사용했는데 왜 안나오는지 착잡하네요...
primer가 DNA에 전혀 binding 되지 않는 현상은 거의 primer 문제일 겁니다.
그리고 B의 저분자 product는 목적에는 맞지 않지만 PCR 반응에서는 정상적으로 증폭된 것으로
보이기 때문에 이것도 primer design상에 착오가 있는 것이 아닌가 합니다.
A와 C는 F, R 중에 하나만 binding 된 결과가 아닌지 DNA 염기서열에서
F, R이 정확이 binding 되는 자리가 있는지 확인해 보세요.
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레벨4
뷰냐
(과기인)
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19.02.01 20:07
Speed님 >> blast 돌렸을때 (F는 그대로, R은 상보서열로) 각 유전자 나오는거 확인했습니다. 애초에 bp값도 blast 결과로부터 계산한 것이거든요. (601부터 865니까 285bp구나! 이런 식으로요)
정확한 실험 내용을 모르는 상황에서는 한계가 있지만..
46~48도에서 primer를 한번 붙여보세요..
보통은 binding되더라도 specific하지 않아서 비특이 band가 많아 annealing 온도를
조정하지만 이 경우는(A, C) 아무것도 안나오니 48도에서 primer가 어디라도
붙은면 여러개의 band가 나올겁니다.
하지만 54~58에서 아무것도 안나오면 48로 해도 아무것도 안나올 가능성이
예상됩니다.
그리고 사용한 template DNA를 가지고 housekeeping gene 중 어느거라도 primer가
있으면 한번 증폭해 보세요..
정상적으로 증폭될 것으로 생각되며 template DNA는 문제없다고 확인 될것으로
생각됩니다.
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레벨4
뷰냐
(과기인)
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19.02.01 21:08
Speed님 > 감사합니다! 액틴 찍어보고 46도에서 각 프라이머들 테스트해보겠습니다. 새해복 많이 받으세요~
PCR producr의 크기가 작다면 loading dye에 BPB가 없는 것을 사용하세요.
작은 DNA는 종종 BPB에 가려서 안보이기도 합니다.
XC만 들어있는 loading dye를 사용하세요.
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레벨6
Applied_Microbe
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19.02.02 16:37
primer design을 할때 몇종류 strains에 대한 염기서열 정보를 보면서 하시는게 좋습니다. 그리고 primer의 염기서열을 그부근에서 약간 수정하는 것만으로도 해결되기도 합니다.
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레벨4
뷰냐
(과기인)
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19.02.02 18:02
제 샘플의 cDNa로 Actin은 잘 나옵니다. 그러나 다른 세 개의 유전자는 48도에서도 pcr이 되지 않았습니다.
Primer 문제가 결론이네요..다들 감사드립니다!