실험 Q&A Mol. Biol.-DNA > PCR/RT-PCR/Q-PCR
PCR 이 안됍니다 도와주세요 ㅠ
레벨1 path 17 (대학원생)
안녕하세요.
PCR 을 하는데 band 가 하나도 안떠서 방법을 찾다가 전문가님들의 조언을 구하기 위해 글 씁니다.
저는 한약재에서 DNA 를 뽑은 다음에 PCR 을 합니다. 크기는 100-200bp 사이이구요.
sequence 확인한 다음에 primer 를 짰구요.
gradient PCR 을 몇번을 했는데 band 가 하나 없이 깨끗합니다.
한약재를 갈은 다음 큐아젠 plant DNeasy mini kit 를 사용해서 DNA 를 추출하고요.
바이오니아 premix에 template 6ul + primer -F 2ul + primer-R 2ul + DW 10ul 넣고 섞어서 95℃,5min - 95℃,20sec-(40℃~62℃),20sec-72℃,30sec-72℃,5min 으로 35cycle 진행합니다.
annealing 온도는 원래 58℃~62℃ 으로 했는데 band 가 하나도 안떠서 온도를 낮춰봣는데도 안나옵니다 ㅠㅠ 원물이 건조한 한약재라 DNA의 농도가 낮긴한데 (3ng/ul 정도 ) 그정도도 PCR 이 된다고 알고있거든요 ㅠㅠ
전기영동은 1% agarose gel 에 loading star 라는 걸 PCR product 에 섞어서 loading 합니다. 전기영동 후 사진을 찍으면 marker 밖에 안보여요
뭐가 문제일까요??
PCR 조건잡는 팁이나 노하우나 해결법을 아시는 분 알려주세요 !!!
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