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RNA의 260/280이 2 근방이면 좋은거 아닌가요?
GAPDH가 샘플마다 일정하란 법은 없습니다. 일정하면 좋겠지만 일정하지 않으면 그걸 바탕으로 보정을 하려고 house keeping gene을 PCR하는 것입니다.
샘플량이 Trizol 부피보다 많았거나,
샘플이 불용성의 지질이나 고분자 탄수화물이 많지 않았나요?
대응책이라면,
(1)
aqueous phase를 따낸 후에 같은 부피의 chloroform(+IAA)로 다시 액/액 추출한다.
(gDNA가 넘어온 경우라면, gDNA 오염 문제가 계속 남음).
(2)
이미 추출한 RNA 라면, acid phenol 처리를 해서 chloroform 추출을 한번 더 한다.
(gDNA 오염문제 해결 가능함).
(3)
새로 시작한다면, 샘플에서 수분을 충분히 제거하고,
시약을 늘이거나, 샘플을 줄이거나 해서 Trizol 시약이 희석되지 않도록 한다.
(다음 번엔 이걸로).
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레벨5
유전학도^^v
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19.01.31 17:10
Polysaccharide나 pigment 같은 것들 때문에 뿌옇게 나올 수도 있습니다.
Aqueous phase를 새 tube에 옮기고 다시 한번 TRIzol을 넣고 처음 과정을 반복하시면 좀 더 깨끗한 상등액을 얻으실 수 있습니다.
RNA extraction buffer 사용시에 고민중입니다님이 얘기하신 현 단계에서 말고,
Isopropanol precipitation 후에 LiCl을 사용하여 purification 할 수 있습니다.
자세한 건 구글에 찾아 보세요.
DNA ethanol precipitation과 비슷합니다.
그리고 DNA의 오염이 의심된다면,
그냥 뽑은 RNA 일부를 agarose gel에 달려 보시면 됩니다.
종에 따라 다르지만 RNA는 보통 3개 이상의 band가 주 되게 선명히 나타납니다.
genomic DNA가 오염가 오염되었거나 RNA가 degradation 되었다면 쉽게 확인 가능합니다.
그리고 purity의 확인은 260/230 ratio를 보셔야 합니다.
Reference의 발현이 cDNA의 문제인지 다른 기술적인 문제인지 확인하시려면요.
참고하세요.
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레벨2
고민중입니다
(대학원생)
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19.02.08 09:58
답변 감사드립니다
제가 DNA contamination을 의심했던 이유가
농도는 충분하게 나오는 것에 비해서 cDNA 합성을 했을 때,
GAPDH가 아예 안보이거나, 희미하게 나오는 경우가 많았고,
같은 RNA를 사용하여 합성하였음에도, GAPDH band의 차이가 나타나는 경우가 보였습니다
다른 실험 과정에서는 문제가 되지 않는 것으로 볼 때, RNA extraction 과정에서의 문제라고
의심하고 있는 상황입니다.