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 전체 > Cell Biology > Cell lysis/Apoptosis
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질문 autophagy 하시는 분들
알xekh13(대학생)  |  2019.01.25 19:01

안녕하세요 대학원 신입생인데요

autophagy를 inhibit/activate하는 compound와 관련된 실험을 하는데

GFP-LC3 cell에 inhibitor(bafilomycin), activator(rapamycin)처리를 해주고 있어요.

1.nagative control로 DMSO를 사용하는데요 bafilomycin,rapamycin이 DMSO에 녹았기 때문에 DMSO가 negative control이라네요 이게 이해가 잘 안되요 ㅠㅠ 왜 DMSO가 negative control인가요?

2.LC3가 형성이 되면 cell에 dot이 관찰되잖아요?? 그럼 DMSO는 어떤 식으로 관찰되어야 하나요? inhibitor activator와 비교했을 때 dot이 적어야 하나요 많아야 하나요?

부탁드립니다 도와주세요 ㅠㅠ

#실험Q&A
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
lenti  |  2019.01.26    
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

1. 어떤 실험이든 마찬가지지만 용매 DMSO+ 용질 X를 넣었을 때 나타나는 현상이 용매인 DMSO에 의한 현상이 아님을 증명하기위해 DMSO만 넣는 control을 둡니다. 이 경우는 MOCK이라고도 표현가능합니다. 


2. 답변하기전에 Autophagy에 전반적인 지식이 아직 없으신 것 같으시니
무작정 실험을 시작하기보단 Autophagy mechanism에 관한 Review들을 읽어보시길 권합니다. 

질문에 답변하자면

LC3-ll dot = autophagosome&autolysosome을 의미하므로 autophagy activator를 넣으면 당연히 늘어납니다. 


Inhibition의 경우 어떤 방식을 사용하나에 다릅니다.

자주 사용하는 bafilomycin A1이나 Chloroquine의 경우 autophagosome 형성 이후의 단계를 저해하기때문에 분해되지 못한 autophagosome이 cytoplasm에 계속 쌓이게 됩니다. 
즉 이 경우에도 LC3-ll dot이 늘어나게 됩니다.

만약 Atg5 K.O시켜 Autophagy를 초기단계부터 억제하게 된다면 Autophagosome 자체가 형성되지 않게되기 때문에 
LC3-ll dot 숫자는 줄어들게 됩니다.

알xekh13  |  2019.01.26   
lenti 선배님 친절한 답변 매우 감사드립니다. control의 개념이 확실하게 잡힌 것 같아요 lc3 dot 분석에 대한 설명또한 감사합니다. 조언하신대로 리뷰논문 열심히 읽어볼게요~
jhl  |  2019.01.30    

LC3 is MAP 1 A/B binding protein and generally appeared as a cytosolic staining pattern, called LC3-I.
However, after c-terminus portion of LC3 is cleaved by ATG4 and PE is attached this part, LC3 can binding to membrane, called LC3-II. This membrane bound LC3-II appeared as bot staining pattern.

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