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infection 시간 별 및 virus 회수 단계 별로 PCR로 확인을 해보시는건 어떻습니까?
어느 단계에서 virus가 사라지는 건지 아니면 실험 방법에 에러가 있는지
알수 있을 겁니다.
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Porte
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19.01.18 18:45
조언 감사드립니다.
혹시 여기 관련 된 specific한 primer나 band size를 알 수 있는 곳이 있을까요? 관련 된 정보를 search해보아도 나오지를 않아서요. 혹시 관련 실험을 진행하고 계신가요?
CR6는 (+)RNA virus이며 약 7.7kbp genome을 가지고 있습니다.
genome의 기능적인 분석은 거의 다 끝났으니 염기서열 중에 일부로 primer를 만들어
cDNA 만들고 PCR해서 확인가능합니다.
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Porte
(과기인)
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19.01.20 01:22
감사합니다.
제가 만약 확인 실험을 하려면 RAW cell에 감염 후 cytopathic effect(CPE)가 보이면 다 모아서 그걸 이용해 cDNA를 합성하면 될까요?
바이러스 실험이 처음이라 어떤 taq을 써야하는지..
무지하네요ㅠㅠ
먼저 CR6 특이적 primer를 디자인해서 primer를 주문해야합니다.
CR6 확인 용 시료는 CPE 시료, CR6 회수 후 시료 2종에 대하여 확인하는게 좋을 듯합니다.
시료에서 RNA 분리, cDNA 합성, CR6 확인 용 PCR 순으로 하면 됩니다.
cDNA 합성은 taq으로 하는게 아니라 RT 반응을 해야 하며 cDNA 합성 후는 일반 taq으로
PCR하면 됩니다.
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레벨1
Porte
(과기인)
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19.01.20 19:53
감사합니다. 그런데 혹시 Norovirus에 관련된 실험을 하시는 분이신지요?
Raw cell을 감염시킬 때 Raw cell이 activation되어있는 것 또한 중요한 부분인 것 같은데..
활성화된 세포가 많아지면 바이러스가 감염을 잘 못할 수도 있다고 생각이 듭니다.
활성화란 뭘 뜻하는가요?
infection 전 seed 시 cell density 약 4 X 10^7 / T175 정도로 하고 infection하면 됩니다.
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레벨1
Porte
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19.01.21 07:42
제가 처음 raw cell을 분양 받을 때 macrophage cell line이라 inactivation이 되어 있는 상태인데 이게 trypsin이나 외부 자극에 의해서 activation되게 되면 길쭉한 morphology를 보인다고 그래서요. 혹시 그런 영향은 아닐까 싶어서 여쭤보았습니다. 근데 이론 상으로는 10^4 pfu/ml -> 10^7 pfu/ml으로 제가 위에서 언급한 방식으로 가능할까요?
Raw cell은 외부 자극 없이 그냥 배양 하면됩니다.
기존 농도로 virus 감염시키면 되고 아마도 회수 과정을 자세히 살펴보는게 좋을 듯합니다.
murine norovirus는 어디서 분양받으셨나요?
저희도 찾고있는데 ATCC 분양은 까다롭네요.