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본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다. |
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뷰냐 | 2019.01.09
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셀 숫자에 대해 파악하려면 우선 well 수 혹은 dish 크기를 알려주셔야 할 것 같습니다. 그리고 cell line마다 크기가 다 달라서 숫자도 다릅니다. stock을 구매한 회사 홈페이지에 들어가 보면 plate별로 꽉 찼을 때 number가 나오기도 하니 참고해보세요.
그리고 1*10^5으로 배양했다는 것이 무슨 의미인지 모르겠습니다. 1*10^5개의 cell을 깔고 싶다는 것인가요? 아니면 1*10^5를 깔아서 며칠이 지난 cell을 계대배양하고자 하는 것인가요?
제 생각에 가능성은 1. cell이 너무 적거나 2. pipetting 후 세포를 소량 따는 것이 늦어서 가라앉아 버렸다거나 3. trypsin-EDTA의 처리 후 세포가 제대로 떨어지지 않아서이거나 정도입니다.
그리고 hemocytometer에 18개 들어왔다 하더라도 적은 숫자일 것 같은데 셀을 좀 더 키워서 계대배양하던지 셀을 깔던지 하는 게 좋을 것 같습니다.
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뷰냐 | 2019.01.09
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18개 정도면 세포 현탁액 1mL당 9*10^4개 있었다는 이야기인데 너무 적습니다. (몇 미리로 희석했는지는 모르겠지만요)
제가 키우는 cell 기준으로, 100파이 기준으로 60% 찼다면 적어도 1.5*10^6개는 있어야 할 듯한데요.
어디선가 loss가 일어나지 않았을까 싶습니다.
원심분리 후 suction 과정 혹은 trypsin-EDTA 처리 과정을 살펴보세요. |
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ea | 2019.01.10
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크기는 60파이구요 처음에 1*10^5개를 깔았습니다!
pipetting한 직후에 세포를 땄고 trypsin-EDTA처리후 cell이 떨어진것도 확인을 했어요ㅠㅠ
cell이 적긴하지만 선배가하면 cell이보이는데 제가하면 cell이 안보이고..ㅠㅠㅠㅠcell이 더 많이 차있는 플레이트에서도 cell이 안보이더라구요
1. 배지석션
2. PBS 4ml넣고 석션
3. trypsin-EDTA 2ml넣고 천천히 흔든 후 석션
4. 2분 incubation(cell떨어진거 확인)
5. FBS 4ml resuspend
6.tryphan blue 20ul, cell 20ul 혼합
(cell따기전에 pipetting)
7.hemocytometer에 20ul넣음
이렇게 진행했습니다ㅠㅠㅠ |
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뷰냐 | 2019.01.10
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60pi plate에 트립신 처리하고
배지 또는 fbs로 희석을 한 후
15mL tube에 옮겨 원심분리를 합니다
트립신을 석션하면 밑에 pellet만 남지요
그 후 배지로 resuspend하고 세포 수를 셉니다.
이 과정대로 진행한 것 맞으시죠?
아니면 펠렛의 양을 보고서도 셀 수를 대략 파악할 수 있습니다. 60파이에 60퍼면 펠렛이 보이긴 보일겁니다. 석션할 때는 펠렛을 피해서 하면 되구요. 원심분리가 지나치게 약하거나 짧으면 셀이 충분히 가라앉지 않을 수도 있습니다. Resuspend할 때 펠렛이 사라지는 것을 보며 잘 섞인 것을 확인합니다. 펠렛이 적당량 맺힌 것 확인하실 수 있었나요?
그리고 같은 샘플에서 선배는 되는데 님은 안 되셨다면 결국 손 스킬의 문제일 듯한데요.
정 안 나온다면 세포 현탁액에서 20uL를 딸 때 팁을 조금 깊숙히 넣어서 취해보세요 |
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ea | 2019.01.10
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저희 실험실에서는 원심분리기를 사용하지않고 cell counting을 하더라구요! 답변해주셔서 감사합니다ㅠㅠㅠ |
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뷰냐 | 2019.01.11
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궁금해서 그러는데 원심분리를 하지 않으면 trypsin-EDTA를 어떻게 제거하나요? |
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ea | 2019.01.12
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석션해서 제거했어요! |
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뷰냐 | 2019.01.13
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원심분리하지 않고 석션하면 cell들이 모두 빨려들어가버리지 않나요? |
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ea | 2019.01.23
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incubation하기 전에는 cell이 아직 플레이트에 부착되어있어서 괜찮아요! |
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