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 전체 > Molecular Biology-DNA > PCR/RT-PCR/Q-PCR
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질문 PCR시 계속 원하는 band size의 2배만큼 size의 밴드가 같이뜹니다...
올챙이월요일좋아(대학원생)  |  2019.01.08 20:33

PCR에 사용한 프라이머를 이용해서 시퀀싱했을때 시퀀싱 결과는 매우 깔끔하게 나왔습니다.


그런데 계속 PCR만 하면 원하는 band size와 그 2배만큼의 size인 band가 같이나오네요..


원하는 밴드 size가 700bp일떄는 700bp에서 매우 굵은 band와 1400bp에서 얇은 band가 같이나오고...


band size가 1kb일 경우 에도 마찬가지로 1kb에는 굵은 band와 2kb에서 얇은 band가 같이나옵니다 


이 경우 컨템이라고 생각해야할까요? 단순한 PCR에 오류인가요...?

#pcr
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
대왕개구리SPEED  |  2019.01.08   

전기영동 관련된 질문은 사진에 모든 정보가 담겨 있습니다.

사진이 없는 상태에서 정확히는 알수 없으나..

증폭시간이 target을 대상으로 정했을 거니까 2배 크기가 증폭될 시간은 안되어

비특이적 증폭은 아니고 전기영동 오류일 겁니다.


꽃개구리Applied_Microbe  |  2019.01.09   
PCR 조건이 어떤지 알려주시는것도 여기 회원님들의 도움 받는데 도움이 될듯합니다
Tap Polymerase 는 1-1.2kb/min의 속도로 합성이 가능하다고 하더라고요 합성시간을 어느정도 하셨는지도 고려하셔야 할것 같고요

Annealing temp.도 고려하셔야 할 듯 하고요
올챙이월요일좋아  |  2019.01.09   

전기영동 사진과 PCR 컨디션 입니다.

먼저 PCR 컨디션입니다.
(PCR시 protocol에 있는 것을 그대로 사용했습니다)

95'C 2m
-----------
95'C 20S
55'C 40S
72'C 1m
----------- 30cycle
72'C 5m

로 진행했으며 F.R Primer의 Tm값은 60도 입니다.

A.
upload image


B. 
upload image

A. 사진을 보고 농도가 너무 높아 그런가? 해서 B. 사진처럼 농도를 낮췄으며 sample을 좀더 늘려봤는데 동일한 결과가 나옵니다.. 나와야하는 size는 정확히 700bp , 1kb가 맞습니다.
전기영동은 100V 30min으로 진행했습니다. 

대왕개구리SPEED  |  2019.01.09   
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

위에 나온것은 비특이 band로 보입니다.

target band외에 상당히 지저분하게 banf가 많네요.

template DNA를 현재의 10분의 1로 줄이고 annealing temp.를 60도에서 해보세요..

60도에서 band가 잘나오면 62도 까지 annealing temp.를 올리면 좀더 깨끗하게

나올겁니다.

올챙이월요일좋아  |  2019.01.09   

감사합니다. 비특이 band라고 봐야겟군요 ㅠㅠ 말씀하신대로 Tm값 조절과 template양 조절해서 확인해보겠습니다.

올챙이월요일좋아  |  2019.01.09   

Template 농도를 줄이고..  Ta값을 60'C ,62'C로 진행했음에도 
지속적으로 질문해서 말씀드린 band가 나오네요... 
이게 어떻게 된 영문인지 ㅠㅠㅠ

A(왼쪽 4개 lane; Ta값 60'C로 진행 , 오른쪽4개 lane: Ta값 62'C로 진행) 
upload image

대왕개구리SPEED  |  2019.01.09   

1. 700bp와 1kb 시료의 template DNA는 크기는 어떻게 되나요?

2. template를 몇 ng 사용했나요?

올챙이월요일좋아  |  2019.01.09   

각각 700bp의 백터는 10,881bp 이며 1000bp의 백터는 11,177bp입니다 


template양의 경우 


4가지 sample (700bp 2개 , 1000bp 2개) 모두 7~8 ng/ul입니다. 

대왕개구리SPEED  |  2019.01.09   

첨부 파일을 음영 조절해서 살펴보니 처음 보다는 고분자 band가 줄어든거 같네요.

62도 30초 72도 45초정도 증폭을 해서 전기영동 할 때 PCR에 사용한것과 동일양의

template DNA A, B를 같이 확인해 보세요.

올챙이월요일좋아  |  2019.01.09   

네 정말이지 감사합니다 ㅠㅠ 

석사들어오고 처음으로 식물체에 형질전환을 위해 Vector를 만들고있어 
부족한 점이 많습니다. 

바로 실험 후에 다시 결과 사진 올리겟습니다.

올챙이월요일좋아  |  2019.01.09   

upload image

PCR조건은 가르쳐 주신걸로 진행하였으나 band가 아직 존재하는걸로 보입니다..

DNA marker를 제외한 2번 lane의 경우에는 단순히 원래 band size에 농도가 낮아 

비특이적인 band가 안보인느거 같습니다

대왕개구리SPEED  |  2019.01.09   

A 2개와 B 2개는 어떤 차이가 있죠?

동일한 clone인데 A-1, A-2, B-1, B-2로 번호만 다른가요?

그리고 marker 분자량이 어떻게 되나요?

올챙이월요일좋아  |  2019.01.09   

upload image
사용한 DNA 마커입니다. 전기영동시 2ug/ng만을 사용했습니다.


A-1,A-2 B-1,B-2 의 경우 번호만 다를뿐 A-1,A-2는 동일한 colony에서 miniprep한 
플라스미드를 이용하여 pcr을 진행했습니다. (물론 B또한 마찬가지입니다)

대왕개구리SPEED  |  2019.01.09   

같은 plasmid 인데 A-2는 증폭양이 갑자기 줄었네요..

같은 조건인데 말이죠..

그럼 A-2 lane 밑에 primer가 안남아 있던가요?

혹시 lab에 현재 사용하는 agarose 말고 다른 agarose가 있으면 그걸로 전기영동을

한번 해보세요..

agarose가 없으면 배지 만들 때 사용하는 agar를 1.5%로 gel을 만들어 전기영동 한번

해보세요..

분명히 3kb 이상은 깨끗해 졌는데 아래에 나오는게 gel 문제가 아닌지 확인을 해보는

것도 필요할 것 같습니다.

gel을 바꿔도 패턴이 같으면

그리고 PCR 조건을 1) annealing을 65도 또는 68도 45초, 72도 35초로 증폭,

2) annealing을 빼고 72도 1분 또는 1분 15초로 증폭을 해보세요..

비특이 band라면 2~3번 조건을 조정하면 대부분 single band로 잘 나왔는데 이경우는

경험상 드문 case라고 생각듭니다.



올챙이월요일좋아  |  2019.01.09   

늦은시간에 답변 감사합니다. 


내일 실험 진행후에 바로 답글 남기도록 하겠습니다

 |  2019.01.10    

PCR 하면 비특이 band가 항상 보이는 경우가 대부분일텐데요
어짜피 PCR 후 target band만 따로 회수해서 다른 vector에 옮겨 쓸 목적 아닌가요?
그렇다면 비특이 band가 나오던 말던 상관없는데요

올챙이월요일좋아  |  2019.01.10   

1) SPEED님
upload image

PCR 조건 1) annealing을 65도 45초, 72도 35초로 증폭 으로 진행하였으며 

gel또한 다른 회사 제품이로 바꿔서 만들어서 실험을 진행했습니다.

근데 매우 고분자 DNA band가 다시 생기네요 ㅠㅠ 정말... 

Primer를 새로 주문했으니 새 Primer로 진행해보도록 하겠습니다.


2) 'ㅇ'님
제가 형질전환 목적으로 Vector를 제작했습니다. 
Sequencing까지는 완료했는데 지속적으로 PCR시 잡밴드가 나와 고민입니다 ㅠ

알Ecological Statistics  |  2019.01.24   

제 입장에서는 PCR시 단일밴드만 정확하게 나오는 경우는 잘 없다고 생각을 합니다.


EtBr 로 staining 하였을 때는 단일로 보여도 SYBR red, gold 등을 사용하는 경우
많게는 수십개의 band를 봤었기 때문입니다.


저희 연구실에서도 EtBr 상에 계속하여 non-specific band 부분이 대체 무엇인가에 대해서 다들 궁금해했고


1. 윗 밴드를 gel extraction 을 하여 새로 PCR을 해보기도 하고

2. 아래 밴드를 gel extraction 하여 다시 PCR도 해보고

3. 위아래 밴드를 각각 cloning을 하여 sanger's sequencing을 하여도 보고

4. 잡밴드가 생긴 sample을 NGS로 분석도 해보고

했습니다만..


저희가 내린 결론은

"dsDNA의 일부 부분이 ssDNA로 denature 되어 size가 큰 형태로 우리 눈에 보이는 것으로 추정된다"

입니다.

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