실험 Q&A Microbiology > Fungi
전기영동 실패 원인
레벨1 요이 (과기인)
4조처럼 결과가 나와야하는데 저희 조는 한 줄의 전기영동 결과가 다르게 나왔습니다. ㅠ 혹시 실패 원인에 뭐가 있을까요..? pcr된 DNA가 문제가 된건가요..? 다른 버퍼나 그런 용액 때문에 그럴 수도 있나요??? 문제의 원인이 무엇인지 모르겠습니다ㅠㅠ
-> 실험 방법은 아래와 같았습니다.
이번 실습에서는, 형질전환(Transformation)된 E. coli의 Plasmid에 PCR
Product가 Insertion되어 있는지 확인하고자 한다. 이를 위해,
▪ Recombinant E. coli의 배양액에서 Plasmid DNA를 추출하고,
▪ EcoRI Enzyme을 이용하여 Plasmid DNA의 특정영역을 자르고,
▪ 전기영동으로 T Vector와 Insert의 길이를 확인한다.
▣ 생각 넓히기
▪ EcoRI Enzyme을 이용하면 플라스미드의 어떤 영역이 잘릴 것인가?
▪ EcoRI Enzyme을 이용하면 정말로 우리가 원하는 플라스미드 영역만 잘릴
것인가?
▣ 재료 및 기구
▪ 형질전환(Transformaton)된 E. coli 배양액 10 ml, Centrifuge, Plasmid 추출
Kit(Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification Systems, Promega),
EcoRI Restriction Enzyme (Promega), Heat block or PCR Machine
▪ <참고> 제한효소 1 unit : 1 μg의 DNA를 최적 온도에서 1시간에 절단
할 수 있는 양
▣ 실습 방법 – Plasmid 추출
01. Promega사의 Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification Systems
Quick Protocol을 토대로 작성하였음.3)
02. 형질전환(Transformation)된 E. coli 배양액10ml을 Centrifuge(Max rpm, 10분)하여 Pellet만 회수한다. (1.5 ml tube로 10,000 rpm에서 15 sec씩 Spin-Down 여러번 해도 됨)
03. 배양액 성분을 없애주기 위하여 DNA-Free 증류수(D.W) 1ml을 Pellet이 들어있는 Tube에 넣고 Pipetting하여, Cell을 Washing한다.
04. Washing된 Cell을 1.7-ml Microtube에 옮긴 뒤 다시 Table-Top Centrifuge(Max rpm, 15 Sec 정도) 실시 후, 상층액(Supernatant)을 걷어낸다.
05. 250ul Cell Resuspension Solution(CRA)을 Pellet이 들어있는 1.7-ml Microtube에 넣은뒤 Pipette으로 잘 섞어준다.
06. 250ul의 Cell Lysis Solution(CLA)을 Pellet이 들어있는 1.7-ml Microtube에 넣은뒤 3~4번 Pipetting 해준다. 또는 Tube를 Interting(Bottom Up and Down) 4회 한다. 1-5분 기다리면서 액체가 맑아지면, 다음 단계로 간다. 5분이상 하면, DNA는 손상됨.
07. 10ul Alkaline Protease Solution을 Pellet이 들어있는 1.7-ml Microtube에 넣은뒤 3~4번 Inverting해준 뒤, 5분 동안 RT(Room Temperature; 22~27 ℃)에서 Incubate한다. 08. 10분 동안 Centrifuge(Max rpm, 14000 rpm)한다.
* Cell wall, 용해된 DNA찌꺼기 등이 바닥에 가라앉는다. (흰색 부유물)
09. Spin Column(필터가 장착된 작은 튜브)를 Collection Tube에 넣어준다.
10. Centrifuge한 Tube에서 상층액 750ul를 Spin Column으로 옮겨준다. (이 때, 흰색 부유물이 섞여 옮겨지지 않도록 유의한다.)
11. 1분 동안 Centrifuge(Max rpm, 14000 rpm)한다.
12. Collection Tube에 모여진 용액들을 버리고 Spin Column에 750ul의 Column Wash Solution(CWA)4)을 넣고 1분 동안 기다린다.
13. 1분 동안 Centrifuge(Max rpm, 14000 rpm)한다.
14. Collection Tube에 모여진 용액들을 버리고 Spin Column에 250ul의 Column Wash Solution(CWA)을 넣고 1분 동안 기다린다.
15. 2분 동안 Centrifuge(Max rpm, 14000 rpm)한다.
16. Collection Tube에 모여진 용액들을 버리고 다시 2분 동안 Centrifuge(Max rpm, 14000 rpm)한다. 17. Collection Tube를 버리고 Spin Column을 빈 1.7-ml Microtube에 꽂은 뒤 Spin Column의 필터위에 50 ul의 Nuclease-Free Water를 넣고 Column에 흡수되게 하여 DNA가 녹을 수 있도록 1분간 기다린다. 18. 1분 30초 동안 Centrifuge(Max rpm, 14000 rpm)한다. 19. Spin Column을 버리고 Plasmid DNA가 포함된 50ul 용액 1.7-ml Microtube를 보관한다. 20. 다음 실험을 위해 Nanodrop등을 이용하여 농도를 측정한다.
▣ 실습 방법 – Enzyme Cut with EcoRI
01. Promega사의 Assembly of Restriction Enzyme Digestions Protocol을
토대로 작성하였음.5)
02. 아래와 같이 Enzyme Cut을 위한 Mixture를 1.7-ml Microtube에 넣어 준비한다.
※ 본 Mixture는 20ul의 Reaction Volume 중 DNA 1 ug에 대하여 최적화 되어있으나, Mini-Prep을 통해 추출한 Plasmid DNA의 농도에 맞춰, DNA의 양을 조절한다. Working DNA Range = 0.2 ug ~ 1.5 ug
Reaction Component Reaction (ul)
Nuclease-Free Water 17.3-X
Restriction Enzyme 10X Buffer 2
Acetylated BSA, 10ug/ul 0.2
DNA, 0.4ug X
Total 19.5
*Performed in a volume of 20ul with 0.2-1.5ug of Plasmid DNA
03. 02번에서 1.7-ml Microtube에 만들어진 19.5 ul 용액에 0.5 ul
Restriction Enzyme (EcoRI, 10u/ul)을 넣어준다. 04. Vortexing(또는 Pipetting)으로 용액을 잘 섞어준 뒤, 1.7-ml Microtube 뚜껑을 닫고 몇 초간 Microcentrifuge를 이용하여 Spin Down해준다. 05. Enzyme의 최적 활성 온도에 맞추어 1-4시간 배양한다.
* Note: Overnight 배양은 DNA의 분해(Degradation)을 유발할 수 있음.
06. 전기영동을 이용하여 정상적으로 Enzyme cut이 실행되었는지 확인한다.
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