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 전체 > Molecular Biology-DNA > PCR/RT-PCR/Q-PCR
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질문 primer desgin 관련 질문 올립니다
알JuneU(대학원생)  |  2018.12.10 17:12
첨부파일 파일첨부: image1.jpg (521 KB)
이미지 첨부파일

이번에 primer3Plus와 NCBI Primer pick program으로 Primer를 짜서 PCR후 전기영동을 해봤는데요...

band가 뜨질 않았습니다 옆에건 GAPDH로 Positive control잡은 거구요
따라서 RNA나 cDNA sample이 이상한건 아닌거 같습니다

oligo analyzer란 프로그램으로 Tm값을 약 60C정도에 맞추고 GC%약 60정도로 맞춰서 제작했습니다
이것 말고도 더 고려해야할게 있을까요?? 아니면 아주 범위를 잘못 설정한 걸까요??

혼자 고민하다가 도저히 원인을 모르겠어서 질문했습니다
선생님들의 좋은 조언 부탁드립니다

#Primer
 
#PCR
 
#DNA
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채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.
첨부파일 파일첨부: image조정.jpg (208 KB)
이미지 첨부파일

보통 primer를 제작하여 결과가 잘 안나올경우 비특이 band와 함께 나오는 경우가

많고 아예 안나오는 경우는 별로 없었습니다만..

이런 경우 annealing temp를 50도까지 내려서 target band와 비특이 band가 동시에

증폭되는 걸 확인하고 annealing temp를 조금씩 올려서 조건을 찾아보는게 좋을 듯

합니다.

그러나 50도까지 anneling temp를 내려도 target band가 안나오면 primer를 다시

디자인하는게 좋을 듯합니다.

그리고 증폭이 안된 lane에 primer가 남아있어야 하는데 primer가 거의 안남아있네요..

primer를 얼마나 사용하나요?

첨부 사진을 조정해봐도 primer가 정상적인 양이 들어가진 앟은 것 같습니다.

대왕개구리SPEED  |  2018.12.10   
전체 reaction vol 20ul에 primer는 10pmol로 희석하여 F/R 0.5ul씩 쓰고 있습니다 
Primer의 양을 더 올려보는게 좋을가요??

그리고 답변 감사드립니다
알JuneU  |  2018.12.10   

100pmole이 아니구요?

primer는 너무 적게 들어갔지만 그래도 증폭이 안되는 이유는 아닐겁니다.

primer가 적은경우 증폭이 되다가 멈춰서 증폭양이 많이 안나오지 아예 안나오는

이유는 아닙니다.

먼저 온도를 50도로 내려 PCR한번 해보세요..

target band가 나오면 annealing temp. 최적화를 하면됩니다.

대왕개구리SPEED  |  2018.12.10   
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