바로 앞전 질문에서 답변을 했습니다. 

전부 떼어내고-stripping- 다시 charging하는 과정을 거치면 Ni가 붙어서 his-taq

정제에 사용가능 합니다.

 만일  speed 님 말씀과 같다면 Ni-NTA column manual에서는 같은  sample 의 경우 5~6번 사용한 후에 stripping과 generation을 실시하라고 했는데


이미 column에 Ni2+과 immidazole이 붙어 있는 상황이라면 5~6번이 아니라 사용 후에 매번 stripping과 generation 과정을 거치는 게 맞는게 아닌지요?

affinity resin을 포함한 binding-elution을 하는 resin은 resin g당 binding capa.가

있습니다.

보통 binding capa.의 100%의 단백질을 loading하여 컬럼을 사용하는 것이 아니기

때문에 1회 사용 후 남아 있는 binding site가 남아있습니다.

protocol 처럼 5~6회라는 것은 얼마의 단백질을 1회 실험에 사용하냐에 따라 달라지고

사용자에 따라 달라질 겁니다.

resin의 full capa.의 80% 정도의 단백질을 실험에 사용했다면 1회 사용 후

stripping-charging해서 다음 실험에 사용해야 합니다.

단백질을 얼마나 사용했냐에 따라 stripping-charging을 해야 할지 결정되며

몇회 사용 후 stripping-charging을 해야 한다는 것은 기준으로 삼기에는 무리가

있습니다.

 저는 그냥 His tag 정제 한 번 하고 레진 regeneration 해줍니다. 단백질 마다 다르긴 하지만 대량 배양하고 정제 하다 보면 눈에 보이지 않는 침전된 단백질들이 레진 사이에 끼게 되고 binding 효율이 좋지 않아지기 때문에 레진 재생 작업을 합니다.

 레진 재생 프로토콜은 여러가지가 있는데 제가 아래에 쓸 내용 정도로만 해도 충분합니다. 정제 끝나면 컬럼을 물로 한 번 씻어주고 EDTA가 포함된 buffer로 니켈 이온을 레진에서 제거 합니다. 니켈이 레진에서 떨어져 나가면 흰색으로 변하게 됩니다. 그리고 다시 물로 워싱 해주고 1M NaOH 용액을 넣어서 침전된 단백질들을 모두 떨궈내줍니다. 약 2시간 이상 진행하는데 피펫 에이드로 피펫팅 해주면서 NaOH로 씻어줍니다. 그리고나서 pH가 중성이 될 때까지 계속 물로 씻어줍니다. pH 종이가 있으면 떨어지는 용액 묻혀가며 확인하기 편합니다. pH가 중성이 되었다면 recharging buffer (50~100mM NiSo4)로 흘려주면 니켈 이온이 레진에 붙어 색이 푸르게 변하고 다시 물로 washing 해준 후 20% 에탄올이 포함된 용액을 넣고 보관 합니다.