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 전체 > Molecular Biology-RNA > mRNA Analysis
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질문 in vitro transcription 반응 후 Band 위치와 수율에 관련된 질문입니다.
알너굴맨(과기인)  |  2018.11.15 11:30


안녕하십니까 선생님들. 석사 졸업 후 in vitro transcription을 진행하게된 뉴비입니다.

다름이 아니라 이번에 실험 진행 후 몇가지 의문에 대해 discussion하고자 글을 남기게
되었습니다.

 먼저 실험조건은 900 bp 정도의 PCR product를 template으로 800 ng 사용 하였으며, N-B 사의 T7 RNA를 1 ul (50 units), rNTP를 final concentraion 각 2mM이 되도록하여
20 ul reaction / 37 도씨 인큐베이터에서 overnight 하였습니다.
 이후 3번 sample에 DNase, 4번 sample에 RNase 처리 37도씨 에서 15분 처리하였으며,
purification은 Ambion의 MAXIscript kit으로 purify 하였습니다.
 각 sample에 대한 nanodrop 흡광도 측정결과는 그림 2.에 첨부되어있는바와 같으며 sample당 10 ul씩 2x denaturing RNA loading buffer와 mix하여 SYBR green으로 post staining 하여 1% native agarose gel에 전기영동 하여 그림 1. 과 같은 결과를 얻었습니다. Size marker는 1 kb DNA ladder로 가장 아래 band가 500 bp, 그윗 밴드가 1kb 입니다.

upload image
그림 1. 전기영동 결과
  upload image
   그림 2. Nanodrop으로 농도 및 순도측정 결과


 우선 결과 자체는 expected result와 유사하게 관찰되어 다행이라고 생각됩니다. 다만 PCR product를 template으로 쓰는 이상 template와 product의 size가 일치 혹은 최소한 유사 해야 할 것으로 생각됩니다. 그럼에도 그림 1. 의 결과를 보면 band size가 거의 2배 가까이 차이가 나는 상황입니다. RNA를 확인함에 있어 denaturing gel을 사용하지 않아 정확한 size의 확인은 불가능 할 것으로 예상은 했지만, 이정도 차이가 날 수 있을지 경험이 없어 판단이 잘 서지 않습니다. ssRNA와 dsDNA의 mobility차이에 의한 것으로 결론 짓고 downstream 실험을 진행해도 괜찮을까요? 아니면 RNA pol이 끝까지 transcription 시키지 못하고 특정 위치에서 termination이 일어난 것으로 봐야할까요....

 두번째로 수율에 관련된 질문입니다. 회사마다 reference마다 1 ug의 template으로 부터 overnight 반응으로 얻을 수 있는 RNA양을 다르게 예측해 놓았더라구요. 적게는 5 ug부터 많게는 100 ug까지 보이던데, 현재 제가 획득한 양이 5 ug 근처입니다. 또한 이 실험 이후에 반응에 필요한 모든 component를 5배 증량하고 반응 시간을 48 hr로 늘려서 반응 후 정량해본 결과 획득량이 약 25 ug 거의 5배 늘었더군요..... 이는 overnight 반응도 시간에 대하여는 이미 saturation이 된거라고 생각 되는데, 욕심일지도 모르겠지만 수율을 올릴 수 있는 방안이 혹시 있을지 선생님들의 의견을 들어보고 싶습니다.

 어쩌다보니 글이 길어지게 되었습니다. 긴 글 읽어주셔서 감사드리며, IVT 실험이 처음인지라 많은 시행착오를 겪고 있습니다. 선생님들의 의견을 들을 수 있다면, 대단히 도움이 될 것으로 생각됩니다. 점심시간이 가까워지는데 식사들 맛있게 하시고 좋은 하루 되십시오.

#in vitro transcription
 
#mRNA
 
#RNA polymerase
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
대왕개구리SPEED  |  2018.11.15   

1. 분자량 관련해서는 1kb dsDNA에서 in vitro transcription 나온 1kb RNA의 경우

동일한 gel에서 함께 내리면 RNA의 실제 분자량은 DNA의 약 50%이기 때문에

분자량 마키와 비교해서 밑으로 내려갑니다.

그걸 감안해서 보시기 바랍니다.

2. 정량 문제는 2, 3번은 어느정도 잘 나왔는데 1, 4번은 한번더 측정 해 보는게

좋을 듯 합니다.

3. 수율 문제는 in vitro transcription 반은 tube 조성이 어떻게 되나요?

위에 나와 있는 건 너무 간단하게 나와 있네요..

알너굴맨  |  2018.11.15   

빠른답변 감사드립니다.

Band 위치가 단순히 길이 뿐만이 아니라 분자량에도 영향을 받는다는 당연한 사실을 생각조차 못하고있었네요... 좋은 말씀 감사드립니다.

 그리고 1번 lane의 경우 polymerase가 들어가지 않은 negative sample이고 4번 lane의 경우 polymerase로 IVT 진행 후 RNase로 RNA를 모두 degradation 시켰습니다. product가 RNA임을 확신하기 위해 포함시킨 실험군 입니다. 이를 감안했을때, expected result라고 생각 되는데 speed 님께서는 어떻게 생각하시나용

 음.. tube별 component라고 말씀하셨는데 더욱 구체적으로 말씀드리자면 900 bp가량의 PCR product dsDNA를 800 ug tube에 넣고 ATP, GTP, UTP, CTP를 각 final concentration이 2mM이 되도록 넣어준 후 , T7 RNA polymerase를 1 ul (50 units) 넣어주어, final volume이 20 ul가 되도록 DEPC treated water로 volume 맞춰주었습니다. 추가로 어떤 정보가 필요하신지 말씀해주신다면 제공하도록 하겠습니다.

대왕개구리SPEED  |  2018.11.15   
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

1. Band 위치가 단순히 길이 뿐만이 아니라 분자량에도 영향을 받는다는 당연한 사실을 생각조차 못하고있었네요... 

: 일반적인 경우 DNA는 DNA 마커와 RNA는 RNA 마커와 전기영동 하는데

현재의 경우 한쪽에 RNA 마커, 또 한쪽에는 DNA 마커를 함께 내리면 각각 분자량

비교하기 편합니다.

2.  그리고 1번 lane의 경우 polymerase가 들어가지 않은 negative sample이고 4번 lane의 경우 polymerase로 IVT 진행 후 RNase로 RNA를 모두 degradation 시켰습니다. product가 RNA임을 확신하기 위해 포함시킨 실험군 입니다. 이를 감안했을때, expected result라고 생각 되는데 speed 님께서는 어떻게 생각하시나용

: 시료는 알겠는데 정량값이 전기영동 결과 하고 많아 다른 것 같아서요..


3. tube별 component라고 말씀하셨는데 더욱 구체적으로 말씀드리자면 900 bp가량의 PCR product dsDNA를 800 ug tube에 넣고 ATP, GTP, UTP, CTP를 각 final concentration이 2mM이 되도록 넣어준 후 , T7 RNA polymerase를 1 ul (50 units) 넣어주어, final volume이 20 ul가 되도록 DEPC treated water로 volume 맞춰주었습니다.

:  buffer나 안정제는 어떻게 되나요?

알너굴맨  |  2018.11.15   

1. 의견 감사드립니다. RNA ladder도 구매하도록 해야겠네요.

2. 그렇군요. 그렇게 생각해본적은 없었네요... 한번도 고려해본적이 없는 문제라 ㅠ 이런 경우는 보통 어떤 문제가 발생한걸로 볼 수 있을까요.

3. Buffer는 T7 RNA polymerase에 동본된 reaction buffer를 사용했으며, 1X concentration에서 40mM Tris-HCl, 6mM MgCl2, 2mM spermidine, 1mM dithiothreitol,  pH7.9 @25도씨 입니다. RNase inhibitor등의 다른 reagent는 넣어주지 않았습니다.

대왕개구리SPEED  |  2018.11.15   
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

피펫팅 문제가 아닌가 합니다.

4번은 농도는 높은데 전기영동에서는 농도가 상대적으로 낮게 나오니까요..

그리고 반응은 protocol에서 ~24h까지 가능하다고 하지만 짤게 하는게 수율이 좋게

나올수도 있습니다.

재료가 남아있다면

1h, 8h, 24h(+BSA/-BSA)로 총 4개를 반응해서 한번 비교를 해보시죠.. 

알너굴맨  |  2018.11.15   

많은 도움이 되었습니다.

시간내어 답변해주셔서 정말 감사드립니다.

좋은 하루 되시길 바랍니다!!

DIGE  |  2018.11.15    
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

37 도씨 인큐베이터에서 overnigh 보다는  37도씨에서 3~4hr 정도 반응하여 실험을 해 보시는것도 좋을듯 합니다.  제 경험상...

알너굴맨  |  2018.11.15   

DIGE님 바쁘신 와중에 답변 감사합니다!

반응시간 줄여서 다시 반응해도록 할게용

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