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 전체 > Molecular Biology-RNA > Small RNA Analysis
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질문 gelatin zymography 관련 질문
알류카넵지(대학원생)  |  2018.11.08 14:35
gelatin zymography 실험에 관련되서 질문을 드릴려고합니다

gelatin zymography의 실험결과 상 쿠마시블루에 의한 파란바탕에 하얀밴드가 뜨는데.

실험 과정에서 먼저 mmp-2와 mmp-9의 활성을 갖게 하기위해 renaturing buffer을 넣어

활성을 시켜 gelatin을 분해한후

그 후 coomassie blue를 넣어서 전체적인 염색후

destaining으로 white band가 뜨는것으로 알고 있습니다.

그런데 white band부분에 원래는 mmp-2와 mmp-9의 활성이 있었던 부분이

그 효소들이 남아있는 자리이기때문에 원래는 coomassie blue에 의해서도 염색이 되지만

protocol상 쿠마시블루 staining 전에 증류수로 겔을 씻어내려 그때 효소도 같이 씻어내리기

때문에 mmp는 염색이 안되고 결국 white band로 뜨는것이 맞나요?
#gealtin
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채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.
Q. protocol상 쿠마시블루 staining 전에 증류수로 겔을 씻어내려 그때 효소도 같이 씻어내리기

때문에 mmp는 염색이 안되고 결국 white band로 뜨는것이 맞나요?

: 아뇨.. 증류수로 gel을 washing 해도 단백질이 빠져나가지 않습니다.

gel에서 단백질을 뽑아 내려면 전기를 거는 방법외에 확산으로는 거의 뻐져 나오지 않습니다.

대왕개구리SPEED  |  2018.11.08   

그러면 쿠마시블루에의해서 mmp가 염색이 되는 부분이 있음에도 불구하고

white band가 뜨는 이유에 대해서는 어떻게 해석해야할까요?

알류카넵지  |  2018.11.08   

실제 동일 양을 전기영동해서 염색한 gel과 zymography gel을 볼 수 있으면 좋겠네요..

MMP 단백질을 많이 loading하면 zymography gel을 염색한 후에도 band가 보입니다.

질문하신 분은 MMP 단백질양을 어느정도 loading하나요?

MMP를 gel에서 활성을 보는 시간이 보통 48시간을 보기 때문에 SDS-PAGE에 안보일 정도

loading 해도 활성이 잘 나옵니다.

대학교 다닐 때 실험 하면서 질문자와 동일한 의문이 들어 실험을 한번 해봤습니다.

SDS-PAGE를 해서 염색하지 않고 48시간 후에 염색을 해봤습니다.

단백질이 빠져 나가지 않나 의문이 들었는데 단백질이 잘 염색되어 나왔습니다.

대왕개구리SPEED  |  2018.11.08   
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