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Q. PCR을 돌리면 이론적으로는 DNA의 양이 2의 30승으로 증폭하게되는데..cycle에 따라 달라지게죠.. 2^20이 될지 2^40이 될지..
Q. 실제 실험을 하게되면 그렇지가 않습니다.왜 그렇게 안된다고 생각하는지 모르겠으나 cycle당 template 증폭에 충분한 시간을 주기 때문에
program과 동일하게 증폭이 됩니다.
Q.그 이유가 주형가닥들이 점점 짧아지기 때문인가요?? 주형가닥이 짧아진다면 PCR product에도 문제가 생기기 때문에 주형가닥에는 아무런 문제가
생기지 않습니다.
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레벨6
Applied_Microbe
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18.10.21 13:40
PCR의 이론 수율과 실제 수율이 달라질 수 있는것은 여러가지가 있는데 요즘은 이변수가 많이 개선된것같긴 합니다
gDNA의 컨디션 문제일수도 있습니다
Mg2+의 양을 조절해야 PCR 이 되는 경우도 있습니다
gDNA solution에 특정 이온의 농도가 높거나 너무 낮을 경우 또는 불순물에 의해서 방해 받을경우
주형DNA의 상태가 나쁠경우 입니다
primer부착부위가 손상되었거나 주형이 온전하지 못해서 증폭에 방해가 될 경우 입니다
Polymerase의 효율 저하
Polymerase의 효율이 증폭 cycle이 증가할 수록 증폭 능력이 떨어질 수 있습니다
초창기 PCR에서는 각 증폭 cycle마다 대장균에서 분리해서 정제한 polymerase를 넣어줬다더군요
Denaturation단계에서 손상되는거죠
dNTP 양의 부족
이건 요즘은 거의 일어나진 않을거에요
PCR tube의 문제
그외 다양한 영향이 있을 수 있습니다
다카라코리아 에서 예전에 발행한 "PCR 백전백승"이란 책을 구해서 읽어보세요
PCR이 개발된 초기에 보였던 여러가지 문제점이 개선되어 요즘에는 실험 목적에 따라
최적의 PCR 효소 및 조건을 사용하면 PCR로 인한 문제는 거의 없을 것으로 생각됩니다.
PCR에서 증폭 효율과 정확성에 중요한 역할을 담당하는 중합효소의 경우 요즘 개발된 효소는
30 cycle 이상까지 수율의 감소가 거의 없습니다. 첨부 사진은 qPCR로 DNA 증폭 효율을
계산한 것인데 동일 DNA를 희석하여 각각을 PCR해서 증폭되는 양을 비교하면 R^2=0.998로
cycle이 적을 때와 많을 때의 증폭 수율이 거의 줄어들지 않음을 볼수 있습니다.