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질문 IHC 수행 이전 조직 prep 후 처리에 관련된 질문입니다.
알꿈꿈이(대학원생)  | 2018.10.15 15:59

IHC 초보 대학원생입니다.



우선 마우스를 sacrifice할 예정인데요,


동결조직절편기 나 파라핀 블록을 처리할 수 있는 기계 (정확한 명칭이 무엇인가요?) 를 통해

조직 절편을 만들어 보관을 하고 싶은데요, 세팅 수준의 실험실이라 많은 것이 부족하여

바로 진행은 하지 못할 것 같습니다.

드릴 질문은,

동결 조직 or Paraffin 조직 으로 IHC를 수행할 경우,

sacrifice한 후, perfusion한 조직을 어떻게 처리해야 하나요?

동결조직의 경우 4% PFA 처리후,

10% sucruose/0.1M PBS , 15, 20% 이런 식으로 처리하는 것 같던데요,

이 과정 중에 절편 전에 멈추고 보관하다가, 공실관에 승인 떨어진 후 진행할 수 있도록

멈출 수 있는  step이 있나요?

고수님들 답변 부탁드립니다.

파라핀 블록의 경우는 어떤 스텝에서 멈출 수 있나요?

동결 절편

#IHC
 
#동결
 
#파라핀
답변하기
답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
개구리Q.E.D.  |  2018.10.15   
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.
IHC를 할 때, 어떤 조직을 사용 할 것인지에 따라서 방법이 나뉩니다.
동결조직과 파라핀 조직 두 가지가 잘려지는 um가 다르고,
파라핀이 침투 하기에 용이하냐 아니냐에 따라서도 다르며
고온에서 조직 변성이 괜찮냐 아니냐에 따라서도 다르기 때문에
이 두 가지 방법의 장 단점을 먼저 확인 후 진행하시기를 바랍니다.

저는 동결조직으로 실험을 진행해서 그 부분에 대한 정보만 첨부해 드릴께요

동결조직을 자르는 기계를 cryocut microtome이라고 부릅니다.
그리고 중간에 멈출 수 있는 스텝은 
조직이 컷팅되기 전 sucrose에 담가져 있을 때와,
조직을 컷팅 한 후 보존용액에 담겨있어서 IHC 1차 항체를 붙이기 전입니다.
그럼 수고하세요.
개구리명품남자  |  2018.10.15   
일반적으로 section 기기 라고하거나 microtome 이라고 합니다. paraffin section이라면 파라핀 마이크로톰으로, cryosection이라면 cryo microtome으로 절편화 하여 분석합니다.

파라핀 기준으로 간단히 설명드립니다.

조직을 포르말린등으로 fixation(고정)후 장시간 보관 가능

포르말린 수세(washing, 포르말린제거)후 파라핀 침투>>embbeding을통한 샘플 방향설정및 block제작후 장시간 보관 가능

조직 section하여 slid glass에 안착시킨 후 장시간 보관 가능 (수개월 이상의 너무 오래된 슬라이드 절편은 사용하지 않는것이 좋습니다~ 물론 별다른 문제는 없었습니다만 일부 연구자들은 사용하지 않더군요) 

IHC/F 는 deparaffinization (xylene등) rehydration (낮은 농도로의 EtOH) antigen retrieval (포르말린에의한 cross linking등의 제거), 적절한 washing후 blocking (IHC의 경우 H2O2포함, 2nd Ab의 host와 동일한 serum및 BSA등으로), 1차 Ab처리후 선호하는 시간만큼 incuvbation (1h~24h이상?)

2차 Ab 처리후 선호하는 시간만큼 incubation하고 분석합니다.

멈출수있다는것이 장기간인지, 수 시간인지모르겟네요

위의 protocol은 제가 일반적으로 하는 step을 간략히 말씀드렷으므로 주변 선배/동료분들의 도움을 받아 분석을 성공적으로 완성하길 바랍니다.  
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