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 전체 > Cell Biology > Cell lysis/Apoptosis
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질문 세포에 10mM H2O2 treatment했는데 전혀 죽지를 않습니다.
앞다리뷰냐(과기인)  |  2018.10.12 16:37
C2C12 cell에 H2O2를 treatment하여 apoptosis를 보려고 합니다.
10mM 농도 (1ml DMEM + 0.86ul H2O2, H2O2는 junsei 35%입니다)로 24h treatment 후 harvest하였는데 세포가 안 죽습니다.... control과 비교하여 아무런 차이가 없습니다.

유통기한이 지난 것은 아닙니다.

원액통은 시약장에서 상온보관이고, 원액을 1ml 정도씩 EP tube에 덜어서 호일로 감싸 종이박스에 실온보관하고 있고요.
실험 바로 전 DMEM에 희석하였습니다.

뭐가 문제일까요? ㅠㅠ 도와주세요
#H2O2
 
#apoptosis
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개구리식스센스  |  2018.10.12   
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.
세포에 따라서 민감도가 다를 수 있습니다.
다양한 농도로 MTT를 먼저 수행한 후에
농도를 설정해서 실험을 진행하는 것이 바람직합니다.
단순히 하나의 농도로 세포사멸 실험을 바로 시작하는 것은
완전히 운을 바라는 것과 같습니다.
실험하는 환경과 사람, 시약보관 상태등이 모두 다르기 때문에
논문에 나와 있는 조건이 있더라도 별도로 test를 해보는 것이 좋습니다.
대왕개구리SPEED  |  2018.10.12   
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.
0.86ul 정도 소량이 들어갈 때 오차가 발생한게 아닌가 합니다.

논문등을 참고해 보면 4mM에서도 H2O2 처리 효과가 나옵니다.

그래서 1차 희석을 해서 1M H2O2를 만들고 1ml DMEM + 10ul H2O2의 양으로 실험을 해보세요.
앞다리뷰냐  |  2018.10.13   
혹시나 해서 실험실에 보관되어 있던 H2O2(35%짜리)의 밀도를 측정해보니 정확히 1이 나왔습니다...
보관이 잘못되었든지 해서 과산화수소가 전부 물이 되어버린 것 아닌가 싶네요

윗분께) 10mM이면 매우 매우 높은 농도(보통 문헌에 500uM 정도 사용) 이기 때문에 treatment했을 때 세포가 죽는 것이 눈으로도 보여야 한다고 생각했습니다.
아랫분께) 실제로 실험을 할 때는 3ml + 2.58uL 이런 식으로 진행했기 때문에 들어가는 것이 눈으로 보였고, 희석의 문제인가 하면 1x를 사용한 것도 있기 때문에 그건 아닌 것 같습니다.


약국에서 H2O2 3%짜리를 사서 실험해볼까 싶네요.
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