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조회 5697  스크랩 인쇄하기 주소복사 트위터 공유 페이스북 공유 
질문 taq과 pfu
??  | 2008.08.14 15:53
답변있는 질문은 수정/삭제 불가(☞문의)
4kb gene을 pcr하고 벡터와 서브 클로닝 후 클론 시퀀싱했더니 몇군데 mutation되었습니다.
pfu가 taq보다 훨씰 muation발생률이 낮다는 것을 읽고 다시 해보려구요


헌데 taq으로 한 pcr조건으로 pfu를 사용했더니 타겟사이즈의 밴드가 안보여요.
taq사용시 특정 온도로 했을때 밴드가 단일밴드로 잘 나왔었는데요.
pfu로 할때는 조건을 새롭게 잡아야할까요??
벡터와 서브클로닝 된 진을 모두 pcr한 것은 아니구요 gene만 pcr할때요.

denaturation 94도/30초 annealing 59도/1분 extension 72도/4분 조건에서
taq으로 했을때 타겟사이즈도 단일밴드 있어서 일루션후 엔자임 잘라 라이게이션
해서 클론 획득했엇거든요.

동일 조건으로 단지 taq대신 pfu썼는데 밴드가 이상한 사이즈가 여러개 보일뿐
타겟 사이즈는 없더라구요.
어쩌죠??
#taq과 pfu
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
금의환향  |  2008.08.14   
시퀀싱 후 다 같은 곳에서 mutation 되었나요?
만약 위치가 다르다면 webcutter 프로그램 같은 것을 이용해서 enzyme 으로 자른 다음 mutation 된 지역을 없애고 ligation 하는 방법을 추천합니다.

제 생각에는 pfu 가 fidelity 는 높아도 위와 같은 문제가 생길 수 있습니다.
꽃개구리TX  |  2008.08.15   
4kb gene을 Taq으로 하시다니요....
제 경우에는 0.5kb 이상은 모두 pfu로 합니다..^^;

일반적으로 Taq에서 PCR 잘되도 pfu로 바꾸면 안되는 경우가 많습니다.
조건 다시 잡으셔야 할듯..

참고로 pfu는 4kp인 경우 extension을 8분으로 하시고 온도는 68도가 좋을듯 합니다..


대왕개구리엘피스  |  2008.08.15   
Pfu는 Taq과 비교하여 processivity가 낮습니다 (초당 합성하는 nucleotide의 수). 즉 같은 size라도 Pfu는 더 많은 extension time과 cycle을 주어야 한다는 뜻입니다.

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