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유전자를 삽입한 MCS에 효소 site가 없으니 그 자리에 유전자가 들어가고 들어가지 않고의 여부에 따라 Blue, White Colony를 구별할 수는 없습니다.
일반적으로 Double Cut을 통해 넣어주게 되면 Self-ligation확율이 거의 없어 항생재를 넣은 Plate에서 뜨는 Colony는 정상적으로 재조합 된 Plasmid가 들어간 Colony일 확율이 큰데요, 결국에 정확한 확인은 결국 Colony Picking이후 키워서 Plasmid를 뽑아 Digestion Pattern확인, Sequencing 방법밖에는 없습니다.
pET15b는 blue/white 선별용 vector가 아닙니다.
vector에 있는 Lac I gene을 보고 Lac Z gene으로 착각하신거 같은데
Lac I gene은 T7 promoter 하류에 있는 Lac O 부분에 결합하는 repressor를 생산하는 유전자
입니다.
따라서 현재 실험에서는 cloning 후 colony PCR이나 직접 vector를 분리한 후 제한 효소로
잘라 insert를 확인하는게 좋을 듯합니다.
colony pcr을 하면 조금더 편하게 insert 유무를 확인할수 있습니다.
저는 1colony를 증류수 100ul에 풀어주고 boiling후 이거 1ul를 template로 PCR을 진행합니다.
밴드가 나오면 insert가 들어갔는지를 확인할수 있습니다.