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질문 PET-15b벡터
올챙이퉁기퉁기(과기인)  | 2018.10.04 18:56
제가지금 pET-15b벡터에 PCR결과 얻은 DNA를 Ligation 시키려고하는데 형질전환이 잘 되었는지 결과로 blue-white screening'쓸수있나요? Lac효소쪽은 제한효소로건드리지않아서 가능할것같은데 맞나요? 근데 이거로는 플라스미드가 cp cell로 잘들어갔는지만확인할수있는거고 원하는 DNA가형질전환된 플라스미드가 들어갔는지는 확인불가능인가요?
#벡터
 
#Blue-white screening
 
#Pet-15b
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
그냥  |  2018.10.04    
유전자를 삽입한 MCS에 효소 site가 없으니 그 자리에 유전자가 들어가고 들어가지 않고의 여부에 따라 Blue, White Colony를 구별할 수는 없습니다.
일반적으로 Double Cut을 통해 넣어주게 되면 Self-ligation확율이 거의 없어 항생재를 넣은 Plate에서 뜨는 Colony는 정상적으로 재조합 된 Plasmid가 들어간 Colony일 확율이 큰데요, 결국에 정확한 확인은 결국 Colony Picking이후 키워서 Plasmid를 뽑아 Digestion Pattern확인, Sequencing 방법밖에는 없습니다.
대왕개구리SPEED  |  2018.10.04   
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

pET15b는 blue/white 선별용 vector가 아닙니다.

vector에 있는 Lac I gene을 보고 Lac Z gene으로 착각하신거 같은데

Lac I gene은 T7 promoter 하류에 있는 Lac O 부분에 결합하는 repressor를 생산하는 유전자

입니다.

따라서 현재 실험에서는 cloning 후 colony PCR이나 직접 vector를 분리한 후 제한 효소로

잘라 insert를 확인하는게 좋을 듯합니다.

대왕개구리안재진  |  2018.10.05   
colony pcr을 하면 조금더 편하게 insert 유무를 확인할수 있습니다.

저는 1colony를 증류수 100ul에 풀어주고 boiling후 이거 1ul를 template로 PCR을 진행합니다.
밴드가 나오면 insert가 들어갔는지를 확인할수 있습니다.
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