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질문 효소 활성을 SDS-PAGE로 보는 방법을 아시는분이있나요?
올챙이또뚜집사(대학원생)  | 2018.10.02 09:00


제가 만든 물질이 cut이 되는지 확인하기위해서 효소를 하나 구매하였는데요,
(OD실험이 정확한것을 알지만 교수님께서 지시한 내용이라 SDS-PAGE로 확인해보려합니다)

혹시 이 prep에 대해 잘 아시는분 있으시면 ㅠ.ㅠ알려주실수있나요?


(효소마다 다 다르겠지만 사용하시는) 효소처리부터

SDS-PAGE까지의 Prep을 알고싶습니다. 부탁드리겠습니다 ㅠㅠㅠㅠㅠㅠ.
#효소
 
#효소활성
 
#SDS-PAGE 효소
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
개구리곰돌2  |  2018.10.02   

효소가 해당 단백질을 cutting하는 효소라면
효소가 활성을 갖는 buffer + 온도조건 + 반응시간을 찾아
단백질과 반응시켜 보시면 될것 같은데요.

그리고 해당 단백질이 그 효소에 의해 잘리는 위치가 있나요?
PAGE 걸어서 효소처리 전 단백질 size와 효소처리후 fragmentation 된것을
staining해서 보시면 될것 같습니다.

대왕개구리SPEED  |  2018.10.02   

SDS-PAGE에서 효소 활성을 확인하는 방법을 Zymogram 또는 Zymography라고 합니다.

주로 protease의 활성을 SDS-PAGE 상에서 확인하는 용도로 많이 사용되었는데

protease가 아니더라도 확인가능합니다.

이 실험이 가능하려면 우선 효소가 분해 할 물질(기질)을 혼합하여 SDS gel을 만들 수 있어야

하며 gel에 포함된 기질이 전기영동에 방해가 없어야 합니다.

구채적인 기질과 효소를 알면 실험 디자인 하는데 도움이 될 것 같습니다.

올챙이또뚜집사  |  2018.10.02   

모두 답변 너무나 감사합니다



제가 사용하는 효소는 prolyl endopeptidase 라는 효소이며, 이 효소를 이용하여
his-pro/his-pro/ cut이 되는 것을 확인하고자 SDS-PAGE상에서 단백질/단백질+효소처리를
로딩하여 확인하고자 하였습니다. 제가 구매했던 회사는 활성 실험을 하지않았다고,

다른 논문을 참고하시던지, 샘플을 구매해서 실험을 해보라고만 답이 와있는 상태였습니다.

그래서 ㅠ_ㅠ 여기에 어떻게 하면 좋을까 조언을 얻고자 올렸습니다.

대왕개구리SPEED  |  2018.10.02   

효소가 자르는 자리는 알겠으나 사용하려는 기질이 무엇인가요?

혹시 peptide를 사용할 계획인가요?

올챙이또뚜집사  |  2018.10.02   
SPEED님



맞습니다! 제가 바실러스에서 발현한 단백질을 농축하여 만들어놓았고, 그 단백질의 CUT을

보고자 SDS-PAGE로 확인하고자합니다!!!
개구리식스센스  |  2018.10.02   
기질인 단백질이 cutting이 되었는지를 확인해서
Peptidase의 활성을 확인하고자 하는 것 같군요.

Substrate가 정제된 단백질이라면 peptidase와 substrate protein을 혼합하여 반응을 시킨 후
SDS-PAGE를 하고 Coomassie staining으로 확인할 수 있을 것 같습니다.

다만, peptidase와 substrate protein의 size 구분이 명확해야 되겠죠.

전기영동시 substrate, substrate + peptidase, peptidase only
이렇게 전기영동을 해서 staining을 하면알 수 있을 것 같습니다.

염려스러운 것은 구매한 peptidase가 정제가 얼마나 잘 되었는지, 
substrate protein의 정제가 얼마나 잘되었는지 사전에 확인이 있어야 될 것 같네요.

말씀하신 것을 알아보고자 하신다면 zymography는 적당한 방법이 아닌 것으로 보입니다.
대왕개구리SPEED  |  2018.10.02   
이 실험은 구매한 1) 구매한 효소, 2) 생산한 단백질을 먼저 전기영동하여 SDS-PAGE pattern을

확인해야합니다.

이 후 생산한 단백질과 구매한 효소를 반응한 후 SPS-PAGE를 해서 생산된 단백질이 분해되고 새로

생성된 단백질을 확인하면 됩니다.
올챙이또뚜집사  |  2018.10.03   

정말 모두에게 감사드립니다 ㅠ_ㅠ

진짜 어떻게 감사의 말씀을 드려야할지 모르겠네요!ㅠ.ㅠ

덕분에 많은 도움을 얻고 갑니다. 열심히 실험해보겠습니다!!!!

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