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질문 qPCR 에서 deltadelta Ct 정량법 질문이요.
앞다리arimari(대학생)  |  2018.09.14 16:13

RT-PCR 실험 후 데이터를 deltadelta Ct 방법이용해서 계산했습니다

근데 여러 논문을 보니 데이터차트를 만들때

y축을 2(-deltadeltaCt) 인 것도 있고
그냥 deltadeltaCt도 있고
log2(-deltadeltaCt) 도 있는데,,,log2fold 도 있고 너무 다양해요..

차이가 뭘까요 ?
유전자형에 따른 mRNA expression level 비교하는 실험인데 어떻게 표시해야할까요?

아 그리고 지금 reference RNA, control RNA, sample 1,2,3 이렇게 사용하고 있는데
deltadelta CT 참고한 논문에서 reference RNA를 사용해서, 저희도 구매해서 쓰고 있긴한데요
control RNA가 있는데 둘다 써야하나요?
reference RNA에서 hkg 발현은 높은데 target gene expression이 낮아서
정량하고 나면 데이터들이 전반적으로 수치가 높게 나와요,,,


너무 어렵네요..ㅜㅜ

#deltadelta
 
#rt-pcr
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BU  |  2018.09.14    
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.
목적에 따라 다르고, 님이 뭘 보여주고 싶은가에 따라 다르죠.

1. Ct : 원래 큐피씨알에서 얻는 싸이클 쓰래시 홀드 값.
2. delta Ct : 한번 빼준 것 (상대적 비교를 한번만 한 값).
3. delta delta Ct : 두번 빼준 것 (상대적 비교를 두번한 값).
4. 2^(-delta delta Ct) : 폴드 채인지 (몇 배 차이 있는지 최종 비교치를 상대적으로 비교한것).
5. 1-4번 중 하나를 사용했는데, 로그까지 씌움 (와이 축)

델타든 씨티든 델타델타든, 님은 큐피씨알을 하고 있어요. 전기영동으로 젤을 보여주는 것과 본질적으로 같은 일을하고 있지만, "수치"로 비교할 수 있어서 더 정확하다고 간주되는 일을 하는 것입니다.

1번에 가까울 수록 "젤로 하여 보여주는 전통적 알티피씨알"과 비슷해지는 것이고,
4번에 가까울 수록 "젤로 보여주지 못하는 이상의 값을 수치적으로 보여주는 것입니다.

"로그"를 씌웠다는 것은, "내 데이터는 상대적으로 비교해 보아도 그 차이가 너무 확연히 달라서, 로그 스케일에서 조차 분명하게 차이가 드러나는, 어마어마한 "낮과 밤" "흑과 백"의 차이를 보여줄 자신이 있어. 그래서 로그 스케일로 보여준다 (고 자랑/과시한다고 생각하면 됨).

2번의 경우를 "Cp" method라고 함. 두번 빼지 않고 한번만 빼서 hkg에 비해 어떻다는 정도만 알려주는 방식임. 이것은 전통적 젤로 보여주는 것에 가까우면서도 "수치"화할 수 있다는 장점을 살린 것.

3,4 번은 패플 (Pfaffle)이 제안한 논문에 가장가까운, 널리 쓰이는 방식이나, 몇 몇의 연구자는 "과장되고 숨기는 정보가 잇다"고 하여 잘 쓰지 않는 경우가 있음.

결론: 로그까지 씌웠으면 정말 "내 데이터는 어마어마하다. 그 차이가 명확하다"는 것을 암시. 1-4번의 선택은 님의 진오브 인터레스트가 하우스 키핑 진에 비해 얼마나 발현정도가 비슷하냐 다르냐에 따라 달리 선택할 수 있겠음.
앞다리arimari  |  2018.09.17   
BU님 답변 정말 감사합니다!!! 너무 도움 많이 되었어요

혹시 delta 정량법에서 reference RNA / control RNA의 사용에 대해서는

조언해주실만한게 없나요? ㅜㅜ
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