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 전체 > Molecular Biology-DNA > PCR/RT-PCR/Q-PCR
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질문 PCR 2band 이유
알챈짱(과기인)  | 2018.09.07 14:14
안녕하세요.
저는 지금 세포에 어떤 stimulant를 처리하여 특이 유전자 발현을 확인하는 실험을 하고있습니다.
정확하게는 qPCR을 해야하지만 band 사진이 필요하여 PCR을 하고 있습니다.

그런데, 두번 반복 실험 중에 문제가 생겨서 질문 올립니다.
화살표가 target product size이고,
왼쪽 사진은 첫번째 실험 결과
오른쪽 사진은 두번째 실험 결과입니다.





첫번째 실험때와 동일한 세포를 깔고 동일한 방법으로 키워 RNA 추출, cDNA합성을 하였고,
PCR을 했는데 증폭산물이 이상한 위치에 뜹니다.

primer contam 확인을 위해 NTC와 이전 샘플로 실험했을 때 문제 없었고
샘플도 house keeping gene로 pcr했을 때 정상 발현합니다. 나머지 primer로 증폭시킨 결과도 첫번째와 두번째 실험 결과가 차이가 없었구요.
조건이 잡혀있는 primer지만, 혹시 몰라 어닐링 온도도 달리 해보았고
cDNA 양도 줄여보았으나 모두 오른쪽 사진의 결과로 나타납니다.

그렇다면 이 문제의 gene 발현의 차이인데 셀웤중에 조작의 실수가 있어서 그런거라면
target band가 안나왔을 수 있겠지만
저는 target 위의 뜬금없는 위치에 band가 뜨는 이유를 도통 알 수가 없네요.
세포는 다시 깔아서 재 실험 하면 되지만 원인 해결은 해야할 것 같아요.

이런 경험 있으신 분 조언부탁드립니다.
#PCR
 
#전기영동
 
#2band
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
올챙이Anoct  |  2018.09.11   
mRNA의 alternative splicing처럼 보이네요.

해당 밴드 잘라서 sequencing해보는게 가장 확실할 것 같습니다.
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