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 전체 > Molecular Biology-DNA > PCR/RT-PCR/Q-PCR
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질문 Genotyping 시 WT 위치에 밴드가 굵은 것, 얇은 것 두 가지가 뜹니다.. 얇은 것도 WT일까요?
올챙이ksyked(과기인)  |  2018.09.06 16:27
genotyping을 하고 있는 중 문제가 발생해서 문의를 드립니다.

질문은 'WT 위치에 아주 얇게 뜬 밴드도 WT gene이 있는 것으로 봐야 하는가' 입니다.

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그림 1)
  wt과 ko primer를 한 튜브 안에 모두 넣고 PCR한 결과.
이 사진에서 TG위치에만 밴드가 뜨면 KO, WT까지 뜨면 hetero, WT만 뜨면 wild type으로 판별합니다. 그래서 굵은 밴드만 인정한다면 5, 8번만 빼고 모두 KO homo가 되고 5, 8번은 hetero가 됩니다. 그런데 파란색 (a) 박스(2, 3, 4번 샘플)에 보이는 것처럼, 아주 얇게 288bp 위치에 밴드들이 떴습니다. 만약 이 밴드들을 wt 밴드라고 본다면 1, 6, 9번만 KO homo가 됩니다. 이 애매함을 해결하기 위해 혹시 이 샘플들을 wt primer로만 돌려볼 때도 밴드가 뜨는지 확인하기 위해 wt primer만으로 PCR을 돌렸고 그림 2)와 같은 결과를 얻었습니다.

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그림 2)  그림1)에서 KO(TG)로 판별된 샘플들을 wt primer만 가지고 PCR한 결과.
그런데 wt primer로만 돌려보니 그림1)에서는 희미했던 밴드들이 진하게 나타났습니다(샘플 1, 3, 6). 그리고 이런 현상은 이 gene뿐만 아니라 다른 gene에 대한 genotyping에서도 나타났습니다. 이를 해결하기 위해 혹시 이런 결과가 prime의 순도가 낮아서 그런 것은 아닌가 싶어서 primer 제작 시 OPC 정제 대신 HPLC 정제로 순도를 높여 주문했습니다. (HPLC 정제로 높이면 비특이 binding primer들이 상대적으로 많이 제거돼 wt primer로만 돌려도 밴드가 안 뜨는 것은 아닌지 싶어서) 
(참고로 그림2)에서 돌린 DNA 샘플들은 조직 준비 시, 혹시라도 1번마우스 이후 2번마우스 조직 준비할 때 1번의 조직이 오염될까봐 커터를 매번 닦으면서 사용했습니다.)

upload image
그림 3) 그 결과, 밴드가 뜨지 않았던 1번 샘플에서는 진한 밴드가 떴고, 그림2)에서 밴드가 떴던 2, 3번 샘플에서는 안 떴습니다. 그리고 6, 7번 샘플에서는 1번 샘플과 달리 연한 밴드가 떴습니다.

-  Primer sequence들과 PCR 조건(touch down이 들어간 방식)은 잭슨랩에서 이 KO 마우스에 대해서 제공한 genotyping용 조건들입니다.
upload image

이럴 경우 질문들이 다음과 같습니다.

1) WT & KO primer를 동시에 돌릴 때, 또는 wt primer로만 돌릴 때 wt 위치에 뜨는 연한 밴드를 wt에 대한 DNA로 봐야 하는지. 즉, 이 마우스를 hetero로 봐야 하는지.

2) 만약 저 얇은 밴드들은 무시해도 되는 밴드들이라면 왜 생기는 것인지

3) primer 정제 순도를 HPLC로 높이면, 예상대로 target gene 이외에 붙는 비특이 primer들이 줄어들고 그 결과 비특이 밴드도 감소하는지.


혹시 이런 경험을 하시고 해결하신 분이나 genotyping에 대한 경험이 많으신 분들께 질문을 드리고 싶습니다.
이 문제가 해결되지 않아서 breeding이 멈춰있는 상태입니다.. 얼른 해결하고 KO으로만 breeding을 시켜야 하는데요..ㅜㅜ
그럼 혹시 답을 아시는 분들께 짧은 조언이라도 부탁 드리겠습니다. 미리 감사드립니다!










#genotyping
 
#PCR
 
#primer
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
(Sorry for English)


In almost all genotyping (for breeding or maintaining a colony), the goal is to identify "the heterozygous animal", because it will be the usual breeder. The way you want to mate the breeders would be;

het x het --> offsprings will be   WT : het : hom at the ratio of 1:2:1 (if following the Mendelian)

Your PCR primer does not have to be HPLC purified in usual circumstances. Given this:

1. It is a stupid idea to run a PCR with "wt과 ko primer를 한 튜브 안에 모두 넣고 PCR한 결과…." ( Don't do this)

2. Find out the primer that will discern "the heterozygous genotype". The Jackson lab must have provided such information to you. If you do not have:
3. Do the PCR using "WT primer" alone using gDNA sample #1-9.
4. Do the PCR using "KO primer" alone using gDNA sample #1-9.
5. Compare results of 4-5. Then, we can further discuss.


BU  |  2018.09.07    
BU님, 답변 감사합니다.

제가 실험 정보에 multiplex primer라는 정보를 누락했었습니다. 잭슨에서 제공한 primer 정보가 multiplex용 primer였습니다.

말씀해주신 대로 각각의 primer pair로 해보는 것이 정석이지만, multiplex용 primer를 한 튜브에 모두 사용할 수 있다고 해서 이렇게 사용했었구요. 그러던 중에 wt 위치에 연한 band가 나온 것이 문제의 시작이었습니다.

이렇게 연한 밴드가 나온 샘플들만 따로 wt primer pair로 돌려봤더니 그 때는 진한 밴드가 wt 위치에 떴었고, 이 샘플들을 HPLC로 정제한 wt primer pair로 다시 돌려봤더니 wt 위치에 밴드가 다시 없거나 연하게 나왔다는 것이 문제점이었습니다.

그래서 드린 질문이, multiplex용 primer로 돌릴 때 나오는 연한 밴드를 positive band로 봐야 하는가, 그리고 HPLC 정제 primer가 일반 정제 primer보다 더 정확한가 입니다.
올챙이ksyked  |  2018.09.07   
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