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(Sorry for English)
In almost all genotyping (for breeding or maintaining a colony), the goal is to identify "the heterozygous animal", because it will be the usual breeder. The way you want to mate the breeders would be;
het x het --> offsprings will be WT : het : hom at the ratio of 1:2:1 (if following the Mendelian)
Your PCR primer does not have to be HPLC purified in usual circumstances. Given this:
1. It is a stupid idea to run a PCR with "
wt과 ko primer를 한 튜브 안에 모두 넣고 PCR한 결과…." ( Don't do this)
2. Find out the primer that will discern "the heterozygous genotype". The Jackson lab must have provided such information to you. If you do not have:
3. Do the PCR using "WT primer" alone using gDNA sample #1-9.
4. Do the PCR using "KO primer" alone using gDNA sample #1-9.
5. Compare results of 4-5. Then, we can further discuss.
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레벨2
ksyked
(과기인)
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18.09.07 10:22
BU님, 답변 감사합니다.
제가 실험 정보에 multiplex primer라는 정보를 누락했었습니다. 잭슨에서 제공한 primer 정보가 multiplex용 primer였습니다.
말씀해주신 대로 각각의 primer pair로 해보는 것이 정석이지만, multiplex용 primer를 한 튜브에 모두 사용할 수 있다고 해서 이렇게 사용했었구요. 그러던 중에 wt 위치에 연한 band가 나온 것이 문제의 시작이었습니다.
이렇게 연한 밴드가 나온 샘플들만 따로 wt primer pair로 돌려봤더니 그 때는 진한 밴드가 wt 위치에 떴었고, 이 샘플들을 HPLC로 정제한 wt primer pair로 다시 돌려봤더니 wt 위치에 밴드가 다시 없거나 연하게 나왔다는 것이 문제점이었습니다.
그래서 드린 질문이, multiplex용 primer로 돌릴 때 나오는 연한 밴드를 positive band로 봐야 하는가, 그리고 HPLC 정제 primer가 일반 정제 primer보다 더 정확한가 입니다.
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podo
(비회원)
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23.02.09 17:44
안녕하세요 ksyked님!
수고많으십니다.
저도 tlr4 KO B6 genotyping을 하던 중
비슷한 문제가 생겨서 해결을 하셨는지 궁금해서 답글 달아봅니다.
잭스에서 제공한 예시 사진과 비교해볼 때 알 수 없는 밴드가 뜹니다.
다른 WT과는 비교하지 않은 상태인데 희미한 밴드는 어떻게 해결하셨나요?