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질문 flow cytometry 방법에 대해서 궁금한게 있습니다.
올챙이thdms0203(대학원생)  | 2018.09.04 14:31
안녕하세요. 
석사 마지막학기 대학원생입니다. 

제가 flow cytometry를 하고 있는데,cell의 surface에 A라는 recetpor가 얼마나 발현되는지를 cell line 별로 비교하고자 합니다. 
 
처음에는 dirtect flow cytometry를 했는데, 같은 농도의 IgG를 넣어준 것에 비해서 A receptor antibody를 넣어줬을 때 histogram이 오른쪽으로 이동하든지 적어도 같은 자리에 있어야 할텐데 오히려 왼쪽에 A receptor antibody의 histogram이 나타납니다. 왜 그런 현상이 나타나는 것인가요?
cell line끼리의 발현양 비교라서 비교야 할 수 있으나, 상식적으로 IgG보다 감소하게 나타나는건 왜그런지 모르겠어요... 하나의 cell line 만 그런 것이 아니라 5가지 cell line이 모두 그렇게 나타납니다. 

질문 1)

제 스스로 생각해본 결과 한 antibody에 붙어있는 fluorophore 수가 다르면 그렇게 나타날 수 있을 것 같은데, 그럼 항체를 농도별로 dilution하여 형광을 측정해서 IgG가 A receptor antibody에 비해 fluorophore 수가 5배 많이 붙어있으면 1/5 농도로 넣어줘도 무방할까요? 

질문 2 )

direct flowcytometry에 이런 문제점이 있어서 indirect flow cytometry를 하려고 하는데,
보통 flow cytometry를 할 때 antibody incubation이 끝나고 vortexing하는 단계들이 있더라구요. cell을 풀어줘야 하기에... 그런데 이 때 너무 세게 vortexing 해버리면 receptor A antibody와 receptor가 떨어지지 않나요? 
저는 떨어질까봐 vortexing하지 않고 손으로 살살 tapping만 해서 측정했고, wash도 많이하면 그만큼 tapping도 많이해야 하니까 일부러 1회만 했거든요. 그래서 IgG 값이 높은 것인가 하는 의문도 듭니다.

flow cytometry 많이해보신 분들 답변 부탁드립니다. 



#flow cytometry
 
#FACS
 
#antibody
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