[DEBUG-WINDOW 처리영역 보기]
즐겨찾기  |  뉴스레터  |  오늘의 정보  |  e브릭몰e브릭몰 회원가입   로그인
BRIC홈 실험
UCC공모전 출품작 홍보
스폰서배너광고 안내  배너1 배너2
전체보기 안전점검 논문교환 LABox
 전체 > Molecular Biology-DNA > PCR/RT-PCR/Q-PCR
조회 1127  스크랩 인쇄하기 주소복사 트위터 공유 페이스북 공유 
질문 overlapping PCR
올챙이rhksdn(대학원생)  |  2018.08.30 18:05
3kb fragment 두개를 이으려는 실험을 하고 있습니다.

두개의 조각이 겹치는 곳이 없어서 우선 overlap되는 부분이 생기게 프라이머를 디자인해서 PCR증폭시켯습니다. 

그 후 
fragment A(700ng/ul) 1ul
fragment B(600ng/ul) 1ul
KAPA(polymerase) 10ul
D.W  8ul

total 20ul로 섞은 후 PCR을 하였습니다. 
PCR 조건은 94(5min), 
             94(30sec), 60(1min), 72(6min), 20cycle
             72(10min)
이렇게 하였더니 3kb 위치와 6kb위치에 두개의 band가 생겻습니다.
근데 6kb위치가 band가 너무 흐려서 gel extraction하여 쓰려니 농도가 너무 낮아서 안됩니다.

더 명확히 overlap PCR로 두개의 합칠수 잇는 조건을 좀 조언해주세요 ! 
#overlapping
 
#PCR
 
#extension overlap
답변하기
검색광고 검색광고
[정코퍼레이션] Cryogenic Barcode Labels -196℃ to +100℃
초저온 냉동(-80℃),액체질소(-196℃),액체질소증기(-150℃) 촉으로 인한 라벨 표시가 떨어짐 현상이 있는 경우에 적합하며, Deep Freezer,LN2 Tank 보관,냉동고용 식별 및 저장에 이상적입니다.
답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
오버래핑은 20 bp만 돼도 가능합니다.
PCR로 얻은 3kb 짜리 두 DNA를 섞고 양끝의 primer 두개만 넣고 PCR을 돌리면 되는데 gradient PCR을 하면 좋습니다.
두 PCR product를 섞을때 50ng 정도만 섞어도 되구요.
만일 최종 PCR 이 잘 안되서 젤에 걸어봤을때 밴드가 흐리다면 그거라도 그냥 elution해서 다시 gradient PCR을 하세요.
elution 한 양이 적어도 어차피 PCR이라는 방법이 미량의 DNA를 증폭할 수 있는 방법이라 괜찮습니다.
대왕개구리강시  |  2018.08.31   
Overlap되게 프라이머를 디자인한 부분은 40bp정도 됩니다.
그럼 겹치는 부분이 생기게 pcr증폭한 후 그 product들을 넣고 양끝 프라이머와 ploymerase를 넣고
위와 같은 pcr 20cycle조건으로 해보되 Ta값을 gradient pcr로 해보면 될까요??
여러가지 조건으로 시도햇는데 잘 안되네요 ㅜ
겔 사잔에 뜨는 6kb는 연결된 fragment가 맞는지도 좀 의심되고 그럽니다 ㅜ
올챙이rhksdn  |  2018.09.02   
답변하기
할인행사 광고 검색광고
그린메이트바이오텍 그린메이트바이오텍
OMNI Homogenizer 20% 할인 이벤트 (12.31까지)
싸토리우스코리아바이오텍 싸토리우스코리아바이오텍
피펫 3+1 & 구매 인증샷 이벤트 (10.31까지)
외부제휴사 광고 AD
e브릭몰
βeta
3/6  좌우
286,700
180,700172,000
668,600334,000
49,700
56,70054,000
286,700
113,500108,000
231,000219,000
101,90097,000
107,200102,000
50,50048,000
231,000219,000
286,700
286,700
286,700
286,700
218,200
144,900138,000
79,80076,000
123,900118,000
82,800
130,00065,000
121,700
137,600131,000
최근등록   더보기 >
DBA/2J mouse 발음 질문입니다.   09.16
0.1M formic acid 계산 문의 입니다   09.16
항쿼럼센싱 억제율 비교 방법과 바이오센서 ATCC 12472 특성 질문   09.16
DPPH 분광광도계 다른거 쓰면 안되나요..   09.16
transfection을 진행한 동물세포에서 gDNA 분리법   09.15
sds page후 염색해도 투명합니다   09.15
3M 일반세균 페트리필름배지인데 Bacillus일까요?   09.15
PEI transfection 이후 media change   09.14
NSC knockdown 실험중   09.13
caco-2 분화   09.12
Springer Nature
ZEUS
위로가기
실험 홈  |  실험FAQ  |  실험 문의 및 제안
 |  BRIC소개  |  이용안내  |  이용약관  |  개인정보처리방침  |  이메일무단수집거부
Copyright © BRIC. All rights reserved.  |  문의 member@ibric.org
트위터 트위터    페이스북 페이스북   유튜브 유튜브    RSS서비스 RSS
에펜도르프코리아