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 전체 > Molecular Biology-DNA > PCR/RT-PCR/Q-PCR
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질문 overlapping PCR
올챙이rhksdn(대학원생)  |  2018.08.30 18:05
3kb fragment 두개를 이으려는 실험을 하고 있습니다.

두개의 조각이 겹치는 곳이 없어서 우선 overlap되는 부분이 생기게 프라이머를 디자인해서 PCR증폭시켯습니다. 

그 후 
fragment A(700ng/ul) 1ul
fragment B(600ng/ul) 1ul
KAPA(polymerase) 10ul
D.W  8ul

total 20ul로 섞은 후 PCR을 하였습니다. 
PCR 조건은 94(5min), 
             94(30sec), 60(1min), 72(6min), 20cycle
             72(10min)
이렇게 하였더니 3kb 위치와 6kb위치에 두개의 band가 생겻습니다.
근데 6kb위치가 band가 너무 흐려서 gel extraction하여 쓰려니 농도가 너무 낮아서 안됩니다.

더 명확히 overlap PCR로 두개의 합칠수 잇는 조건을 좀 조언해주세요 ! 
#overlapping
 
#PCR
 
#extension overlap
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
대왕개구리강시  |  2018.08.31   
오버래핑은 20 bp만 돼도 가능합니다.
PCR로 얻은 3kb 짜리 두 DNA를 섞고 양끝의 primer 두개만 넣고 PCR을 돌리면 되는데 gradient PCR을 하면 좋습니다.
두 PCR product를 섞을때 50ng 정도만 섞어도 되구요.
만일 최종 PCR 이 잘 안되서 젤에 걸어봤을때 밴드가 흐리다면 그거라도 그냥 elution해서 다시 gradient PCR을 하세요.
elution 한 양이 적어도 어차피 PCR이라는 방법이 미량의 DNA를 증폭할 수 있는 방법이라 괜찮습니다.
올챙이rhksdn  |  2018.09.02   
Overlap되게 프라이머를 디자인한 부분은 40bp정도 됩니다.
그럼 겹치는 부분이 생기게 pcr증폭한 후 그 product들을 넣고 양끝 프라이머와 ploymerase를 넣고
위와 같은 pcr 20cycle조건으로 해보되 Ta값을 gradient pcr로 해보면 될까요??
여러가지 조건으로 시도햇는데 잘 안되네요 ㅜ
겔 사잔에 뜨는 6kb는 연결된 fragment가 맞는지도 좀 의심되고 그럽니다 ㅜ
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