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질문 Empty vector(공벡터) 제작시 ligation 질문입니다!!
올챙이rhksdn(대학원생)  |  2018.08.30 09:19
공벡터를 제작해서 보관하려고 하는 대학원생입니다.


pbluescript SK 2 vector에 다른 fragment가 들어있는 plasmid를 가지고 있었습니다.

이 것을 fragment를 제한효소로 제거하고 약 3kb의 pbluescript SK 2 vector만 확보하여 E.Coli에 넣어서 확보하려고 합니다.

제한효소 2개를 사용하여 원하는 크기의 밴드 위치를 gel extraction하여 잘 추출하였습니다.

그 다은 T4 DNA Ligation으로 다시 plasmid형태로 만들어서 cloning시키려하는데

이렇게 하면 제한효소 다른 2개로 짤라서 다시 ligation이 잘 되나요??

제한효소는 EcoR1, BamH1 사용하여 잘랐습니다.

#Ligation
 
#제한효소(restriction enzyme)
 
#empty vector(공벡터)
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
올챙이Anoct  |  2018.08.30   
EcoRI, BamHI으로 자른 sticky end는 서로 맞지 않습니다.

그대로는 ligation이 안될 거예요.

엔자임 처리 하셔서 blunt end 만든 후에 ligation하시길..

ㅡ.ㅡ;  |  2018.08.30    
이론상으로는 절대 ligation이 되면 안되죠.



근데... vector를 두개의 enzyme site로 자르고 insert도 그에 맞는 site로 준비하여 ligation해보면 vetor가 self ligation 된 경우가 흔하게 나타냅니다.



blunt ligation도 좋지만 klenow가 없거나 하면 그냥 한번 test겸 해보심도 좋을듯.

다만 꼭 sequencing해서 어떻게 연결됐는지는 확인해 봐야겠죠.
올챙이Anoct  |  2018.08.30   
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.
서로 다른 엔자임으로 잘랐을때 ligation되어 콜로니 뜨는 경우는 세가지입니다.


1. 안 잘림.
2. 한쪽만 잘림.
둘다 insert 제대로 안 빠진 경우입니다. 맞는 size 젤만 잘 추출했어도 분명 섞여 있어요. 
vector 사이즈 대비 insert 사이즈가 크지 않다면 더욱 구분하기 어려울 거구요.

3. 안 맞는 sticky end가 붙음.
이게 두번째 분이 말씀하신 경우입니다. 생물학에서 100%는 없으니까요.


klenow 처리를 안 하고 그냥 ligation 진행시 뜨는 콜로니는 위 셋 중 하나인데..
어차피 최종 시퀀싱은 하셔야겠지만, 1,2번이 걸릴 경우 불필요한 시행착오를 겪으실 수 있어요. 
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