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학부생인데 저는 실험실 선배한테 dsDNA는 온도가 높아질수록 점점 가닥이 분리되고 ssDNA가 되기때문에 denaturation 온도보가 낮은 Annealing 온도에서 DNA가닥들이 서로 가까워져서 template에 primer가 붙는데 이 온도가 낮아질수록 template와 primer가 더 가까워져서 specificity가 떨어지는 걸로 배웠습니다.
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레벨1
Derek
(대학원생)
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18.08.29 19:58
답변 감사합니다. 학부생이신데 저보다 잘 아시는거 같아 부럽습니다ㅎ
JIN:) 님께서 말씀하신 부분 중에
"이 온도가 낮아질수록 template와 primer가 더 가까워져서 specificity가 떨어진다."
라고 하셨는데, template와 primer가 더 가까워진다는 거는 더 잘 붙는다는 말씀아닌가요?
더 잘 붙는게 specificity와는 상반되는 의미인거 같은데요..?
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레벨6
Applied_Microbe
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18.08.29 20:18
Primer를 Design할 때 forward primer와 reverse primer의 Tm 값을 되도록 같게 해주라고 하는데... Tm 값이 primer가 50% 결합하는 온도입니다. 그게 anneaning temp.의 온도에 따른 specificity 조절 시 변수를 제거하기 위해서라고 볼 수 있습니다. 그리고 double strand DNA가 온도 상승을 통해서 single strand DNA로 나눠진 상태에서 (그 DNA 의 GC% 에 따라서 온도에 따른 DNA의 상태에 조금씩의 차이를 보임)온노를 낮추기 시작하면 Single strand DNA의 상보적인 염기서열들 사이에 수소결합이 복원되면서 결합이 시작되는데..... 온도가 너무빠르게 내려가게 되면 곳곳에서 mismatching이 나타나게 됩니다. DNA가 있는 buffer 의 온도가 상승하면, DNA 염기서열간의 수소결합보다 주변의 에너지가 높아지기 때문에 염기간의 결합이 떨어지지만 주변온도가 낮아지고 염기서열간의 수소결합력보다 주변의 에너지가 낮아지면 DNA가 다시 염기간의 결합력이 복원되면서 double strand DNA로 돌아가게 되는 것인데... 오류를 수정할 시간을 주질 않고 빠르게 온도를 낮추면 오류를 수정할 수 없는상태에서 수소결합에 의래서 결합이 되어버리기 때문에 원래 붙어야 할 곳에 붙질 못하고 상보적이지 못한 곳에 결합할 수 있게됩니다. primer의 경우도 Denaturation에서 annealing단계로 진행하는 과정에서 annealing 온도가 너무 낮을 경우에는 DNA 염기간의 수소결합이 상대적으로 강해지면서 primer가 상보적인 위치로 이동하기에 필요한 에너지가 부족해져서 specificity가 떨어지게 됩니다. 저 상황에서 annealing temp를 조금씩 상승시킬 경우 primer가 상보적인 위치로 이동할 수 있는 상태가 되면서 비상보적 위치에 결합된 상태에서의 구조적인 저항에 의해서 다시 상보적인 위치로 primer가 이동할 수 있게 됩니다.
순간접착제가 너무 빨리 작용해서 결합부위 조정하기 전에 두 물체가 붙어버리는 것을 생각하셔되 되겠네요
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레벨1
Derek
(대학원생)
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18.08.29 20:32
Applied_Microbe님
단번에 이해갔습니다...ㅠㅠ
너무 감사해요.. 다시 잘 읽어보고 그림 그려가면서 생각해보겠습니다
정말 감사합니다 선배님!!ㅎㅎㅎ
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레벨6
Applied_Microbe
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18.08.31 09:01
심화학습을 원하시면( "PCR primer 2 edition:Laboratory manual" cold spring harbor 2009)를 도서관에서 빌려보세요
이 책에서는 열역학법칙인 엔탈피와 엔트로피를 이용해서 설명합니다
DNA star라는 software도 엔트로피를 이용해서 primer의 self dimer와 primer dimer를 설명합니다