[DEBUG-WINDOW 처리영역 보기]
즐겨찾기  |  뉴스레터  |  오늘의 정보  |  e브릭몰e브릭몰 회원가입   로그인
BRIC홈 실험
웨비나모집
스폰서배너광고 안내  배너1 배너2 배너3 배너4
전체보기 안전점검 논문교환 LABox
 전체 > Molecular Biology-DNA > PCR/RT-PCR/Q-PCR
조회 1490  스크랩 인쇄하기 주소복사 트위터 공유 페이스북 공유 
질문 PCR 원리 중 이해가 가지 않는 부분이 있습니다.. 도와주세요..ㅠㅠ
알Derek(대학원생)  |  2018.08.29 18:34
현재 cloning 공부와 실험을 이제 막 시작한 대학원생입니다.


PCR 원리와 관련하여 궁금한 것이 몇가지 있어서, 여러 선배님들께 조언과 가르침을 받아보고자 풀리지 않는 의문을 올려보게 되었습니다.


1. Primer를 디자인 하여 PCR을 수행할 시에(gradient PCR을 하지 않았다는 가정하에), product가 multi band가 뜨게 되면 annealing temperature를 올려보고, 실제로 그렇게 온도를 올리면 multi band가 뜨지 않고 원하는 예상 사이즈에 one band로 예쁘게 뜨는 것을 볼 수가 있었습니다. 정확한 원리가 너무나 궁금합니다. 왜 annealing T를 높이면 specificity가 증가한다고 하는 것인지 이해가 가지 않습니다.

2. 1번 질문과 연결하여 제가 추측을 해봤습니다. annealing T를 올려서 특이성이 높아지는 것이, dsDNA가 ssDNA로 확실히 denaturation 시킨다면 primer가 붙는 specificity가 높아져서 멀티 밴드가 안뜨는 것은 아닐지?

3. denaturation step에서 이미 ssDNA로 변성을 시켰는데, 왜 뭐 때문에 또다시 annealing T에 의해서 primer의 specificity가 달라지는 것인지 너무나 궁금합니다... 도와주세요...ㅠㅠ 
#PCR
 
#annealing temperature
 
#primer
답변하기
검색광고 검색광고
[정코퍼레이션] Cryogenic Barcode Labels -196℃ to +100℃
초저온 냉동(-80℃),액체질소(-196℃),액체질소증기(-150℃) 촉으로 인한 라벨 표시가 떨어짐 현상이 있는 경우에 적합하며, Deep Freezer,LN2 Tank 보관,냉동고용 식별 및 저장에 이상적입니다.
[(주)필코리아테크놀로지] BHQ quencher의 원천기술을 가진 Biosearchtechnologies의 oligo
미국의 Biosearchtechnologies는 일반적인 BHQ probe부터 다양한 customized oligo를 제공합니다. IVD 회사에서도 인정한 Biosearch oligo의 quality를 느껴보세요. 주문 02-2105-7020 042-862-9636 info@philekorea.co.kr
답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
학부생인데 저는 실험실 선배한테 dsDNA는 온도가 높아질수록 점점 가닥이 분리되고 ssDNA가 되기때문에 denaturation 온도보가 낮은 Annealing 온도에서 DNA가닥들이 서로 가까워져서 template에 primer가 붙는데 이 온도가 낮아질수록 template와 primer가 더 가까워져서 specificity가 떨어지는 걸로 배웠습니다.
알JIN:)  |  2018.08.29   
답변 감사합니다. 학부생이신데 저보다 잘 아시는거 같아 부럽습니다ㅎ

JIN:) 님께서 말씀하신 부분 중에

 "이 온도가 낮아질수록 template와 primer가 더 가까워져서 specificity가 떨어진다."
 
  라고 하셨는데, template와 primer가 더 가까워진다는 거는 더 잘 붙는다는 말씀아닌가요? 
  더 잘 붙는게 specificity와는 상반되는 의미인거 같은데요..?
알Derek  |  2018.08.29   
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

Primer를 Design할 때 forward primer와 reverse primer의 Tm 값을 되도록 같게 해주라고 하는데... Tm 값이 primer가 50% 결합하는 온도입니다. 그게 anneaning temp.의 온도에 따른 specificity 조절 시 변수를 제거하기 위해서라고 볼 수 있습니다. 그리고 double strand DNA가 온도 상승을 통해서 single strand DNA로 나눠진 상태에서 (그 DNA 의 GC% 에 따라서 온도에 따른 DNA의 상태에 조금씩의 차이를 보임)온노를 낮추기 시작하면  Single strand DNA의 상보적인 염기서열들 사이에 수소결합이 복원되면서 결합이 시작되는데..... 온도가 너무빠르게 내려가게 되면 곳곳에서 mismatching이 나타나게 됩니다. DNA가 있는 buffer 의 온도가 상승하면, DNA 염기서열간의 수소결합보다 주변의 에너지가 높아지기 때문에 염기간의 결합이 떨어지지만 주변온도가 낮아지고 염기서열간의 수소결합력보다 주변의 에너지가 낮아지면 DNA가 다시 염기간의 결합력이 복원되면서 double strand DNA로 돌아가게 되는 것인데... 오류를 수정할 시간을 주질 않고 빠르게 온도를 낮추면 오류를 수정할 수 없는상태에서 수소결합에 의래서 결합이 되어버리기 때문에 원래 붙어야 할 곳에 붙질 못하고 상보적이지 못한 곳에 결합할 수 있게됩니다. primer의 경우도 Denaturation에서 annealing단계로 진행하는 과정에서 annealing 온도가 너무 낮을 경우에는 DNA 염기간의 수소결합이 상대적으로 강해지면서 primer가 상보적인 위치로 이동하기에 필요한 에너지가 부족해져서 specificity가 떨어지게 됩니다.  저 상황에서 annealing temp를 조금씩 상승시킬 경우 primer가 상보적인 위치로 이동할 수 있는 상태가 되면서 비상보적 위치에 결합된 상태에서의 구조적인 저항에 의해서 다시 상보적인 위치로 primer가 이동할 수 있게 됩니다.

순간접착제가 너무 빨리 작용해서 결합부위 조정하기 전에 두 물체가 붙어버리는 것을 생각하셔되 되겠네요

꽃개구리Applied_Microbe  |  2018.08.29   
Applied_Microbe님


단번에 이해갔습니다...ㅠㅠ
너무 감사해요.. 다시 잘 읽어보고 그림 그려가면서 생각해보겠습니다


정말 감사합니다 선배님!!ㅎㅎㅎ
알Derek  |  2018.08.29   
심화학습을 원하시면( "PCR primer 2 edition:Laboratory manual" cold spring harbor 2009)를 도서관에서 빌려보세요
이 책에서는 열역학법칙인 엔탈피와 엔트로피를 이용해서 설명합니다
DNA star라는 software도 엔트로피를 이용해서 primer의 self dimer와 primer dimer를 설명합니다
꽃개구리Applied_Microbe  |  2018.08.31   
답변하기
할인행사 광고 검색광고
그린메이트바이오텍 그린메이트바이오텍
OMNI Homogenizer 20% 할인 이벤트 (12.31까지)
싸토리우스코리아바이오텍 싸토리우스코리아바이오텍
피펫 3+1 & 구매 인증샷 이벤트 (10.31까지)
외부제휴사 광고 AD
e브릭몰
βeta
1/6  좌우
50,50048,000
107,200102,000
144,900138,000
286,700
286,700
123,900118,000
180,700172,000
79,80076,000
121,700
286,700
56,70054,000
668,600334,000
82,800
101,90097,000
218,200
231,000219,000
137,600131,000
49,700
286,700
113,500108,000
130,00065,000
286,700
231,000219,000
286,700
최근등록   더보기 >
macrophage 부착관련 질문   09.23
고등학교 알긴산나트륨 추출   09.23
Mac Conkey Agar에서 S.aureus가 자랐어요!! 이게 가능한가요?!   09.23
미백저해실험하는 방법좀 알려주세요   09.22
ELISA IL-1b 측정하려는데 capture antibody를 어떻게 해야하는지 모르겠...   09.22
protein refolding 과정 이전의 washing(isolation)step 문제   09.22
실험쥐 사용하려고 하는데   09.22
인슐린농도 단위가 뭘 뜻하는건지 잘 모르겠습니다   09.22
배지의 특성에 대해 알고 싶습니다.   09.21
두 균주 간의 DNA 비교 방법이 궁금합니다.   09.21
로고스바이오시스템스
ZEUS
위로가기
실험 홈  |  실험FAQ  |  실험 문의 및 제안
 |  BRIC소개  |  이용안내  |  이용약관  |  개인정보처리방침  |  이메일무단수집거부
Copyright © BRIC. All rights reserved.  |  문의 member@ibric.org
트위터 트위터    페이스북 페이스북   유튜브 유튜브    RSS서비스 RSS
에펜도르프코리아